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sumo蛋白酶切不开带sumo标签的蛋白的原因?

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丁香实验

带有His标签和sumo标签的蛋白,用sumo酶30度酶切2-3小时不能切开,问题会出在哪?怎么解决?

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24 个回答

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dxy_d4xj2yg7

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1. SUMO酶活性不佳,加对照蛋白验证酶活性有没有问题。 2. 有可能是蛋白结构问题,标签的结构可能不正确,酶无法识别标签。可以考虑换个其他标签,比如EK,3C等。
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是小杨同学

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我觉得可能是酶的时间有点长了,然后酶失活了,或者可以检查一下温度的问题
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lzy必有我师

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1,注意切割酶的活性;2,注意切割酶的切割效率,是否加了足够的酶;3,设置阳性对照,换别的以前切割过的his或者sumo标签蛋白作为阳性对照,检查是否酶或者自己蛋白的问题。4,增加切割时间,同时,检查切割酶的切割buffer是否正确。
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dxyhsx123

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确认两个问题,一酶是不是有活性,二是不是有对应的标签。确认这两个问题后,应该就解决了。
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一支肾上腺素

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酶是否过期,还有一个温度是否适宜,掌握好这两点,应该是可以切开的。
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医往情深丁香园

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这些酶切位点特异性都比较高,但切割效率各不同,除了SUMO蛋白酶之外,其它常用蛋白酶切除标签后都会残留几个氨基酸残基。
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zxb597

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要查看试剂盒是否过期,或者盐浓度问题。
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JCorona

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1.纯化后的蛋白鉴定了吗?确定成功表达出目的蛋白了?目的蛋白确定带有稳定的标签?2.酶保存不当或者过期,结果就是酶失活了
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dxy_h7vcp8v3

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其一,检查切割酶是否有活性;其二,检查切割酶的切割效率,是否加了足够的酶;其三,设置阳性对照,换别的以前切割过的his或者sumo标签蛋白作为阳性对照,检查是否酶或者自己蛋白的问题。其四,增加切割时间,同时,检查切割酶的切割buffer是否正确。
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dxy_w4oj7yoe

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首先要排除蛋白酶的活性问题,然后可以增加酶切时间,另外buffer盐浓度也会影响酶切效率,可以尝试提高盐浓度,如果都不行可能是表达的问题,目的蛋白把sumo标签包埋在内部蛋白酶接触不到了,这种可以在sumo和蛋白之间加一小段linker,当然完全可以再换几种tag试一试
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于小闹0808

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如果是一直都切不开,也是正常的,有些蛋白确定很难切开,可能是由于三级空间结构的问题,也有可能是切开效率不高。如果是切开效率不高,那么你需要优化一系列参数,比如说温度、酶量、酶切时间、酶活是否足够、另外自身样品缓冲液环境、也要考虑是否含有蛋白酶等等
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ZZDX-YILILI

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1.酶切试剂盒是否在有效期内,之前使用这个试剂盒是否正常。确定试剂盒有效。检查酶切反应体系。 2.SUMO差不多30℃一小时就能切开。
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dxy_pni5ki46

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不知道酶切时候酶和底物的比例怎么样,酶切的缓冲液ph之类的条件如何。酶切切不下来一般是条件不适合或者活性不够,试试增加酶量,适当延长时间。或者4度过夜试试。
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jey1235

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确定了酶切位点没问题?site前后需要加短linker能有利于暴露位点。在我记忆中,Ulp1的酶切效率非常高。如果site没问题,是不是切错蛋白或者Ulp1已经失效了? 做个WB看看,确认一下目标蛋白带了tag
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z流沙z

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首先考虑酶有没有过期,然后是快切酶还是慢切酶
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dxy_qkedgrg7

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正常来说这个温度和时间应该是可以切开的,如果酶切开很有可能是酶失活了,活性降低了,可以延长时间会换个新的试试
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dxy_bq4uxnd

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有没有可能是酶使用过程不规范,效价降低,可以重新买一管酶,或者延长作用时间。
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dxy_4uyyu09r

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确定载体能正常表达吗?如果蛋白正常的情况下那就是酶的问题,换个新的试试,或者找以前好用的蛋白做对照。
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飞天幻雪

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首先要确保蛋白没问题,是否表达正常和带标签。其次你这个酶的活性还有待确定,另外酶切的时候保证体系里面的ph和盐粒子等因素都会影响切割
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Guoood

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确保酶是工作的,cut buffer也很关键,避免反复冻融,其他原因需要考虑片段酶切位点附近保护碱基是否足够。
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