细胞蛋白做WB无趋势的原因？
丁香实验
最近在提细胞蛋白做WB，主要是内参和磷酸化的通路蛋白，但是一直跑不出来趋势（别人有做过的）
0.75板子，10％的胶，电泳上层胶80mV→下层胶100mV，电转200mA，根据分子量转不同时间，碧云天快封封闭，一抗CST的。想知道原因以及如何解决
内参很细，如下图2张：
通路蛋白很粗，且毫无趋势（第一个是对照组，应该最低，后面是不同时间加药，也没有趋势），而且感觉通路蛋白形态比较奇怪，黑黑的一片。下图2张
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15 个回答
隔壁家的小夜猫子
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点太多了，你想看趋势的时候尽量少点，可以摸索几次，点少了之后内参也可能能更清楚地看出并不齐，可能需要重新normalize
红格子一号
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可能上样量偏高，建议确定浓度后，调整上样量，减少上样，减少曝光时间
ZZDX-YILILI
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先排除实验最终正确的结果来说，抗体和实验过程应该是没有问题的。我分析原因如下:
1.首先拿别人做过的细胞系和别人的抗体重新做一遍，看能不能重复出别人的结果。来再次确定细胞系和抗体都没有问题。
2.另外加的药物和别人的是一样的吗？如果不一样那看来就是药物对这个细胞没有影响。
dxy_h7vcp8v3
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首先WB检测蛋白含量很灵敏，目前实验蛋白条带粗细一致。可能的原因其一，自己操作过程失误，未能还原文献中的结果，建议仔细阅读文献多看关键步骤; 其二 可能差异很微弱，因为你每组上样量都偏高，导致WB检测的条带都很黑，建议减少蛋白样品上样体积；其三，仔细检查自己试剂是否有问题，建议实验设置阳性对照，排除实验试剂问题。
cathyxjjxjj
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我感觉wb分辨率比较有限的，定量能力没有那么强，如果样本含量本身差异不大，没有数量级的差异，应该看不出的，用质谱定量应该可以。
dxy_bq4uxnd
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内参很细是不是曝光时间太短，延长曝光时间可以变粗，目的蛋白没有差异，可能有两方面的原因，一是蛋白本身不受这个处理的影响，所以没有变化，二是抗体有问题，显现的为非特异条带。
jey1235
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不同条带粗细对比基本毫无意义。完全就是分子量和蛋白电泳迁移效率的问题。
操作上看结果没有问题，你这属于求助具体课题内容，但是又不给背景。别人做出来你做不出来太司空见惯了。
再次细胞生物学重复不出来的情况还少吗？
非要分析，就要看别人的条件是不是和自己完全一致，细胞 抗体 treatment 之列的。
dxy_pni5ki46
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灰度值分析一下看看，肉眼看起来差别不大但是实际上可能不一样。再一个wb条带没有明显的变化有可能与实验处理有关，实验处理得不到预期结果都是常态，可能实验条件，试剂纯度，药物浓度不合适等，需要多重复试验
dxy_4uyyu09r
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你蛋白和抗体应该都没问题，表达量可以，抗体特异性也很好，你应该把注意力放再你这个药物的使用浓度或者效果上，很有可能失效了或者对于你用的细胞类型不起作用
z流沙z
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总蛋白可以是没有趋势的，然后磷酸化蛋白发生变化
bamboopiggy
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抗体和蛋白都感觉没问题，如果你做磷酸化，建议加入磷酸酶抑制剂看看吧，我是感觉你的药可能有问题
飞天幻雪
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不知道你加的这个药是否影响mrna水平，如果有影响建议先做个定量看看是否有增加。其次你这个蛋白水平表达量也太高了，比内参都要强，这样很难看出趋势。建议减少上样量。同时未处理的对照组多跑两个做对照
vae1476
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别人有做过，重复不出来趋势也是有的，你可以拿他们的样本你做一下wb或者，你的样本交给他们来做，试试，这种一般不会是wb操作的问题
verbalkint
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条带不是很好看但是没什么大问题，加一个正对照，比如这个蛋白的inhibitor，确定能看到敲低的那种，看看是不是抗体不好用。另外加药的浓度梯度拉开一点，看到趋势之后再缩小浓度范围
Guoood
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趋势是要看你所处理的细胞是否工作，并不是每次处理就一定会工作跑WB出趋势。你得保证操作方法和所用物品药物没有失效，最好现配现用。从图来看，跑胶条件和条带没有太大问题，可以尝试处理几份细胞跑一下看看。
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