WB转膜SIRT1蛋白一直失败的原因？

丁香实验

2022-01-12

最近在做WB，转SIRT1这个蛋白，CST说明书参考分子量是120KDa
电泳时候是配10%的胶
湿转的转膜条件有使用过 360mA 1h, 1.5h, 2h；300mA 2.5h的全部没有转过去
用考马斯染胶，可见130附近有蛋白。
转膜液的配置是：Tris 3.03,甘氨酸 14.4g ，甲醇200ml ，然后定容到1000ml。
其他同学差不多分子量的用360mA 1.5h都可以成功，不知道各位有没有什么解决方法。

24 个回答

医往情深丁香园

2022-01-21

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说明你抗体有问题或者目的蛋白表达量有问题。如果他的也转不过去。

是小杨同学

2022-01-20

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有没有可能1.内部短路了2.抗体方面的问题3.没有封闭好

内科小护士

2022-01-20

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如果其它蛋白都正常的话，只有这个蛋白失败，应该考虑抗体的问题，如果多次尝试还是这样应该考虑抗体是否工作。

兔子爱吃鱼

2022-01-20

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没有说明怎么确定没转过去的，marker可以看到吗？是条带爆不出来吗？会不会是抗体有问题，可以立春红染一下看看蛋白条带对不对，这个条件也有可能转过了

JCorona

2022-01-20

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没有转过去是全部没有转过去还是marker转过去了蛋白没有？也可能转过去了，只是显影失败，原因可能是：1.一抗灵敏度低（考虑是否构象依赖型）；2.标记物失活，有可能是引入了污染例如叠氮化钠会灭活HRP；3.虽然你和你同学电流控制一致了，但是否电压也一致？若不一致可能导致你的转过头或者没转上；4.转模板是否平整？是否有气泡影响膜与胶的贴合？5.海绵垫、滤纸等是否有短路？你跟你同学都拿彼此的样品一起做一次相互对照，互相帮对方检查所用的仪器、试剂，看是操作的问题还是所用的东西质量问题。

dxy_9kptsiw

2022-01-19

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1，Marker是否转上去，如果是，转膜应该没问题 2，一抗新鲜配置 3，二抗也需要新鲜配置我们一般用300ma恒转

一支肾上腺素

2022-01-19

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转膜时间是否太长了，有可能蛋白已转到PVDF膜背后的滤纸上，甚至缓冲液中了，我们转膜的条件是80伏，1小时。内部短路了，胶碰到了膜后面的滤纸，电流大部分绕过膜走了，当然转不上。查找原因的办法很简单，转膜结束后，将膜和胶分别用丽春红和考马斯亮蓝染色，在膜没上色的前提下，如果胶上有条带，说明是短路了。

dxy_w4oj7yoe

2022-01-19

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不知道你的marker转的怎么样，如果marker基本都转到膜上的话，正常说明转膜应该没有问题。也不知道你是如何知道你的蛋白没有转过去的，因为正常情况下就算蛋白大部分都转到膜上了，胶上也还会有残留的蛋白能被考染检测到，如果你是用抗体检测的，最好再确定一下抗体质量，或者直接染一下膜看看转膜的情况。转膜buffer你可以试一试这个：24mM Tris ，39mM 甘氨酸，20%甲醇，0.0375% SDS（ph必须大于8.0，SDS浓度小于0.1%，也可以不加）

dxy_h7vcp8v3

2022-01-19

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建议可以采用半干转仪器。半干转转膜成功率较好，时间也短。如果想继续湿转，可以100v恒压转2h；其次检查自己抗体是否过期，可以新鲜配置。

于小闹0808

2022-01-19

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是不是内部短路了，胶碰到了膜后面的滤纸，电流大部分绕过膜走了，就会转不上。

ZZDX-YILILI

2022-01-19

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120kda蛋白质不算特别大的蛋白如果是湿转的话，恒压80V转膜3个小时左右就可以了如果是半干转的话，电压20V转膜30分钟，可能效果会比湿转差一些。

dxy_pni5ki46

2022-01-19

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我们转大分子有时候会在转膜液加sds，有的做出不来的会做出来

jey1235

2022-01-19

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如何确定的是一定没有转过去？有没有可能转过头？buffer没有大问题，看看是不是膜的问题？会不会样品的浓度本身就不高，以至于检测不到？建议：将胶跑的时间久一些，让大分子量的尽量分离开，小蛋白直接跑出去，然后试试转一下，正常情况120kd还是很轻松能转过去。检查一下转膜体系。

z流沙z

2022-01-19

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200mA转膜1.5h肯定没问题，我蛋白跟这个差不多大小

dxy_qkedgrg7

2022-01-19

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我做的实验也是120kDa大小的蛋白，400mA，100min就可以转过去了，转膜液配方也没问题，应该不是转膜的问题。你说的考马斯亮蓝染色有条带，那转膜后是孵育不出来吗，那可能是抗体的特异性不好，不是一个物种的？有个简单的方法可以看出来是不是你转膜的问题，marker在180kDa转过去了吗，如果可以的话就是你抗体的问题了，或是没封闭好之类的