M13引物菌液PCR鉴定同一重组质粒的不同单菌落出现大小不一的条带是什么情况？
dxy_rnjaajn5
重组质粒通过同源臂连接，挑取8个单克隆，过夜摇菌后使用M13引物（载体上位于目的片段两端）进行菌P，条带都很单一，但结果有4个菌落条带较高，有4个较低，大概相差100-300bp左右（8个条带均位于1000-2000之间），我的目的条带大概1350bp，空载体扩增结果条带大小应该在300bp左右，我比对了一下我的序列和载体序列以及同源臂和引物，均没有问题，请问这种情况是什么原因造成的？
3 个回答
沫子大大
模板DNA的浓度可能会影响扩增产物的大小,
但不同克隆在PCR反应条件上可能存在差异，如退火温度、延伸时间、引物浓度等。这些差异都可能导致扩增产物的大小存在差异。克隆体中可能存在着突变，这些突变可能会影响PCR扩增的结果。如果重组质粒存在染色体DNA污染，那么PCR扩增的产物大小也可能存在差异。
dxy_mqg1dtg8
这种情况可能是由于PCR扩增反应中模板DNA的数量不同或PCR扩增条件不一致导致的。
可能的原因包括：
1. 模板DNA的数量不同：不同单克隆中模板DNA的数量可能存在差异，如有些单克隆中模板DNA浓度较高，而有些单克隆中模板DNA浓度较低，会导致PCR扩增反应中所用的模板DNA数量不一致，从而影响扩增产物数量和大小。
2. PCR扩增条件不一致：如反应温度、时间、引物浓度、酶浓度等条件不同，会导致PCR反应的特异性和效率不同，从而影响扩增产物的数量和大小。
针对这种情况，可以尝试以下措施来解决：
1. 调整PCR反应体系：如使用同样的反应体系，控制好PCR反应条件的一致性，尽量减小扩增反应中模板DNA数量和PCR条件对扩增产物的影响。
2. 优化PCR扩增条件：如调整反应温度、时间、引物浓度、酶浓度等条件，以提高PCR反应的特异性和效率，减少PCR扩增过程中的误差。
3. 扩增多个单克隆：扩增多个单克隆，筛选出产物最纯净、大小最接近目的片段的单克隆进行后续实验。
4. 对扩增产物进行纯化和测序：对扩增产物进行纯化和测序，以确定扩增产物的大小和序列是否符合预期，进一步排除其他可能的影响因素。
loveliufudan
可能的原因包括：
1. 混合物问题：在挑取单克隆之前，可能存在混合物中的不同克隆，导致你观察到多个条带。这可能发生在转化或挑取单克隆的过程中。
2. 重组事件多样性：同源臂连接可能会导致多种不同的重组事件发生，包括插入、缺失或其他改变。这些事件可能导致了不同大小的条带。
3. 重组位置：同源臂连接的位置可能会对重组产物的大小产生影响。某些位置可能更容易产生较大或较小的条带。
4. 载体结构变化：重组事件可能导致载体的结构变化，例如重组片段的重复序列或其他插入物可能导致不同大小的条带。
