为什么巢式PCR失败且第二轮很多smear？

可能是由以下原因造成的：

模板DNA质量差：模板DNA质量对PCR反应影响较大，如果模板DNA质量差，可能会影响PCR扩增效果。建议使用高质量的模板DNA，并通过紫外光谱仪等方法检测DNA质量。

反应条件不合适：PCR反应条件是影响PCR扩增效果的重要因素，如果反应条件不合适，可能会导致PCR失败。建议优化反应条件，包括温度、时间、引物浓度、MgCl2浓度等因素。

引物设计不合适：引物的设计是PCR反应成功的关键之一，如果引物设计不合适，可能会导致PCR失败或smear出现。建议使用合适的引物，并进行引物的特异性检测。

PCR反应体系有干扰：PCR反应体系中存在其他干扰物质，如酶抑制剂、盐等，可能会影响PCR扩增效果。建议检查PCR反应体系中是否存在干扰物质，并进行适当调整。

PCR扩增产物太长：如果PCR扩增产物太长，可能会影响PCR反应效果，特别是第二轮PCR。建议优化PCR反应条件，或者选择更短的扩增片段。

综上所述，建议仔细检查PCR反应体系和反应条件，并进行优化和调整。如果仍然无法扩增出目标片段，可以考虑更换引物，或采用其他PCR方法进行扩增。

建议按以下步骤进行操作：

第一步：目标的DNA模板蓝色的第一对引物结合。第一对引物也可能结合到其他具有相似结合位点的片段上并扩增多种产物。但只有一种产物是目的片段（图中未显示可能的多种产物）。

第二步：使用图中红色标记的第二套引物对第一轮PCR扩增的产物进行第二轮PCR扩增。

由于第二套引物位于第一轮PCR产物内部，而非目的片段包含两套引物结合位点的可能性极小，因此第二套引物不可能扩增非目的片段。这种巢式PCR扩增确保第二轮PCR产物几乎或者完全没有引物配对特异性不强造成的非特异性扩增的污染。

考虑引物不合适，建议检查引物再做