急求大佬解决qpcr问题

D走失的猫

2022-07-20

本人小白，做的组织RNA，内参gap值一直很高，平均ct值在25左右，跑过最小的在19，最大的值都到30多，而且，对照组，实验组1和实验组2，三组之间ct值一直不齐，差的还挺多！

蓝色的线是gap

Eason老歌迷

2022-07-20

有帮助

可能还是你的体系问题。我的经验，在20 ul 的逆转录系统中加入1 ug RNA。然后将cDNA稀释50到100倍，（即1 ul的RT产物加49 ul 水），取 2ul 用于qRT-PCR （20 ul 体系）。GAPDH的Ct 值在19～20范围内。

天一湖医者

2022-07-20

有帮助

如果你确定你RNA提取逆转过程没有问题的话，直接将高浓度的稀释一下就行。

whilt-shirt

2022-07-20

有帮助

看一下溶解曲线，有可能是引物特异性不好，也有有可能是组织RNA降解了

bamboopiggy

2022-07-20

有帮助

可能gapdh在你的实验中不适合做内参，你换个内参例如用actin试试