实验小助理静静
求问大家,我需要把两个厌氧菌养到一起养成生物膜。需要对其中细菌的数目分别定量。想用qpcr绝对计数,需要找到两个菌中的差异基因。不知道可否用两个菌的23srRNA设计特异性引物绝对计数?如果可行的话有没有具体的引物设计方法。麻烦大家帮我解惑,万分感谢!
迟C迟
可以,找到23srRNA序列,按照qPCR引物设计原则:
1. 引物长度:18-25bp;
2. GC含量:30%-80%,最好是40%-60%;
3. 引物Tm值最好在60℃左右,上下游两条引物Tm差异不要超过4℃;
4. 避免引物与目的基因之间发生错配,特别是引物3端,不要超过6个碱基;
5. 避免特定碱基的连续重复,特别是引物3端出现3个或以上连续的C或者G重复;
6. 避免引物自身形成发夹结构;
7. 避免引物之间形成二聚体,特别是引物3端;
8. 引物设计跨内含子,这里上下游引物可以在不同的外显子,或者同一个引物刚好跨两个外显子;
9. 80-300bp,150bp最适长度,相对短的扩增产物,扩增效率会要高;
秋秋欣欣
可以的,可以用突变的特异性引物
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