Taqman探针怎么设计？荧光基团怎么选择 ？

探针设计的基本原则：

1． 保守：探针要绝对的保守，有时分型就单独依靠探针来决定。理论上有一个碱基不配对，就可能检测不出来。若找不到完全保守的片段，也只能选取有一个碱基不同的片段。且这个不同的碱基最好在探针的中间，对探针与目的片段的杂交影响不大，不相同的碱基最好不要在两端，因为两端不利于探针的杂交。且最好为A或T，而不能为G或A，因为A、T为双键，而G、A为三键。

2． 探针长度

Taqman探针的长度最好在25-32bp之间，且Tm值在68-72℃之间，最好为70℃，确保探针的Tm值要比引物的Tm值高出10℃，这样可保证探针在退火时先于引物与目的片段结合。

3． 探针的名称

应标记探针在基因组的位置及长度。

4． 探针Tm值计算

用oligo或primer preiemer软件即可计算Tm值。确保探针中GC含量在30-80%。应避免探针中多个重复的碱基出现，尤其是要避免4个或超过4个的G碱基出现。

5． 探针的评价

6． 探针的5'端不能为G，因为即使单个G碱基与FAM荧光报告基团相连时，G可以淬灭FAM基团所发出的荧光信号，从而导致假阴性的出现。

7． Taqman探针与引物之间的位置

Taqman探针应靠近上游引物，即Taqman探针应靠近与其在同一条链上的上游引物

探针荧光基团的选择

一般5'端的发光基团可以根据你的需要选择，理论上，5'端标记的荧光受设备激发发射的波长应该是3'端的激发波长，所以如果你5'端用的是FAM（最常用的荧光染料之一），而FAM受激发发射的中心波长是521nm，这样3'端就要选择激发波长在521nm左右的荧光染料（淬灭基团）。淬灭基团受激发后也会发射荧光，即背景荧光，对检测带来噪声，所以现在3'端也较常使用不发光的淬灭基团如Eclipse，可以降低背景干扰

探针选择要保守，引物选择要保守，因此必须找一段100-200bp相对要保守的片段来设计引物与探针。

一般5'端的发光基团可以根据你的需要选择，理论上，5'端标记的荧光受设备激发发射的波长应该是3'端的激发波长，所以如果你5'端用的是FAM（最常用的荧光染料之一），而FAM受激发发射的中心波长是521nm，这样3'端就要选择激发波长在521nm左右的荧光染料（淬灭基团）。淬灭基团受激发后也会发射荧光，即背景荧光，对检测带来噪声，所以现在3'端也较常使用不发光的淬灭基团如Eclipse，可以降低背景干扰。

探针选择要保守，引物选择要保守，因此必须找一段100-200bp相对要保守的片段来设计引物与探针。即real-time PCR的扩增片段是50bp-150bp。当找不到150bp的保守片段时，必须确保探针的片段是保守的。

探针设计的基本原则：

1． 保守：探针要绝对的保守，有时分型就单独依靠探针来决定。理论上有一个碱基不配对，就可能检测不出来。若找不到完全保守的片段，也只能选取有一个碱基不同的片段。且这个不同的碱基最好在探针的中间，对探针与目的片段的杂交影响不大，不相同的碱基最好不要在两端，因为两端不利于探针的杂交。且最好为A或T，而不能为G或A，因为A、T为双键，而G、A为三键。

2． 探针长度

Taqman探针的长度最好在25-32bp之间，且Tm值在68-72℃之间，最好为70℃，确保探针的Tm值要比引物的Tm值高出10℃，这样可保证探针在退火时先于引物与目的片段结合。因此探针最好是富含GC的保守片段，保证其Tm值较高。现在有Taqman MGB探针，在TAMER之后再标记一个MGB，可使探针的Tm值较高，即使探针片段较短，也可达到Taqman探针的Tm值要求(68-70℃)。