跑荧光定量pcr 曲线有双峰,primer设计引物分数是满分，求大神给个建议。

如果是主峰前面出峰，一般是引物二聚体，如果是后面，可能是非特异扩增，可降低引物浓度，退火温度和镁离子浓度

是不是引物二聚体，你做个阴性对照（只加引物，不加模板）就知道了。不过看峰的位置，是非特异的扩增，与你的引物或者cDNA有关，你已经试过了多种退火温度都没有改善，说明它影响不大。cDNA反复冻融，容易降解，尤其是浓度比较低的时候；引物可以换另一种引物尝试做。

1.primer设计的引物分数是针对引物扩增的评价，没有二聚体、错配或发卡结构，所以你得到的分数比较高。

2.设计好的引物建议去比对一下，可以用NCBI等网站blast，分析引物特异性。

3.设计qpcr引物，推荐NCBI，首页最下面有个primer-blast，可以设置不同长度和产物等条件的引物，关键是能够通过选择物种保证引物特异性。

荧光定量pcr 曲线有双峰，你做相对定量了吗，将样品结果与对照看看基因表达量分析就可以了！ 如果绝对定量，需要进一步实验吧！

双峰说明还是特异性不高，有引物二聚体，可以再换一个低一点的试一下

你说的是melt curve是双峰吧，这说明你的pcr产物不是单一产物，虽然软件给你是满分，但是你去blast一下看看，是不是还有别的结合？