primer5和Oligo结合设计引物步骤及心得
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一、引物设计 step by step
1 、在 NCBI 上搜索到目的基因，找到该基因的 mRNA ，在 CDS 选项中，找到编码区所在位置，在下面的 origin 中， Copy 该编码序列作为软件查询序列的候选对象。
2 、用 Primer Premier5 搜索引物
① 打开 Primer Premier5 ，点击 File-New-DNA sequence, 出现输入序列窗口， Copy 目的序列在输入框内（选择 As ），此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白。点击 Primer ，进入引物窗口。
② 此窗口可以链接到 “ 引物搜索 ” 、 “ 引物编辑 ” 以及 “ 搜索结果 ” 选项，点击 Search 按钮，进入引物搜索框，选择 “PCR primers” ， “Pairs” ，设定搜索区域和引物长度和产物长度。在 Search Parameters 里面，可以设定相应参数。一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长度可以适当变化，因为 100 ～ 200bp 的产物电泳跑得较散，所以可以选择 300 ～ 500bp.
③ 点击 OK ，软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分（ Rating ）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在 “ 引物窗口 ” 中，显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。
④ 对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况： 3’ 不要出现连续的 3 个碱基相连的情况，比如 GGG 或 CCC ，否则容易引起错配。此窗口中需要着重查看的包括： Tm 应该在 55 ～ 70 度之间， GC ％应该在 45 ％～ 55 ％间，上游引物和下游引物的 Tm 值最好不要相差太多，大概在 2 度以下较好。该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为 “None” 为好。但有时很难找到各个条件都满足的引物，所以要求可以适当放宽，比如引物存在错配的话，可以就具体情况考察该错配的效率如何，是否会明显影响产物。对于引物具体详细的评价需要借助于 Oligo 来完成， Oligo 自身虽然带有引物搜索功能，但其搜索出的引物质量感觉不如 Primer5.
⑤ 在 Primer5 窗口中，若觉得某一对引物合适，可以在搜索结果窗口中，点击该引物，然后在菜单栏，选择 File-Print-Current pair ，使用 PDF 虚拟打印机，即可转换为 Pdf 文档，里面有该引物的详细信息。
3 、用 Oligo 验证评估引物
① 在 Oligo 软件界面， File 菜单下，选择 Open ，定位到目的 cDNA 序列（在 primer 中，该序列已经被保存为 Seq 文件），会跳出来两个窗口，分别为 Internal Stability （ Delta G ）窗口和 Tm 窗口。在 Tm 窗口中，点击最左下角的按钮，会出来引物定位对话框，输入候选的上游引物序列位置（ Primer5 已经给出）即可，而引物长度可以通过点击 Change － Current oligo length 来改变。定位后，点击 Tm 窗口的 Upper 按钮，确定上游引物，同样方法定位下游引物位置，点击 Lower 按钮，确定下游引物。引物确定后，即可以充分利用 Analyze 菜单中各种强大的引物分析功能了。
② Analyze 中，第一项为 Key info ，点击 Selected primers ，会给出两条引物的概括性信息，其中包括引物的 Tm 值，此值 Oligo 是采用 nearest neighbor method 计算，会比 Primer5 中引物的 Tm 值略高，此窗口中还给出引物的 Delta G 和 3’ 端的 Delta G.3’ 端的 Delta G 过高，会在错配位点形成双链结构并引起 DNA 聚合反应，因此此项绝对值应该小一些，最好不要超过 9 。
③ Analyze 中第二项为 Duplex Formation ，即二聚体形成分析，可以选择上游引物或下游引物，分析上游引物间二聚体形成情况和下游引物间的二聚体情况，还可以选择 Upper/Lower ，即上下游引物之间的二聚体形成情况。引物二聚体是影响 PCR 反应异常的重要因素，因此应该避免设计的引物存在二聚体，至少也要使设计的引物形成的二聚体是不稳定的，即其 Delta G 值应该偏低，一般不要使其超过 4.5kcal/mol ，结合碱基对不要超过 3 个。 Oligo 此项的分析窗口中分别给出了 3’ 端和整个引物的二聚体图示和 Delta G 值。
④ Analyze 中第三项为 Hairpin Formation ，即发夹结构分析。可以选择上游或者下游引物，同样， Delta G 值不要超过 4.5kcal/mol ，碱基对不要超过 3 个。
Analyze 中第四项为 Composition and Tm ，会给出上游引物、下游引物和产物的各个碱基的组成比例和 Tm 值。上下游引物的 GC ％需要控制在 40 ％～ 60 ％，而且上下游引物之间的 GC ％ 不要相差太大。 Tm 值共有 3 个，分别采用三种方法计算出来，包括 nearest neighbor method 、％ GC method 和 2(A ＋ T) ＋ 4(G ＋ C)method ，最后一种应该是 Primer5 所采用的方法， Tm 值可以控制在 50 ～ 70 度之间。
第五项为 False Priming Sites ，即错误引发位点，在 Primer5 中虽然也有 False priming 分析，但不如 oligo 详细，并且 oligo 会给我正确引发效率和错误引发效率，一般的原则要使误引发效率在 100 以下，当然有时候正确位点的引发效率很高的话，比如达到 400 ～ 500 ，错误引发效率超过 100 幅度若不大的话，也可以接受。
⑤ Analyze 中，有参考价值的最后一项是 “PCR” ，在此窗口中，是基于此对引物的 PCR 反应 Summary ，并且给出了此反应的最佳退火温度，另外，提供了对于此对引物的简短评价。若该引物有不利于 PCR 反应的二级结构存在，并且 Delta G 值偏大的话， Oligo 在最后的评价中会注明，若没有注明此项，表明二级结构能值较小，基本可以接受。
⑥ 引物评价完毕后，可以选择 File － Print ，打印为 PDF 文件保存，文件中将会包括所有 Oligo 软件中已经打开的窗口所包括的信息，多达数页。因此，打印前最好关掉 Tm 窗口和 Delta G 窗口，可以保留引物信息窗口、二级结构分析窗口（若存在可疑的异常的话）和 PCR 窗口。
4 、引物确定后，对于上游和下游引物分别进行 Blast 分析，一般来说，多少都会找到一些其他基因的同源序列，此时，可以对上游引物和下游引物的 blast 结果进行对比分析，只要没有交叉的其他基因的同源序列就可以。
二、引物设计过程中的心得
1 、 Primer 5.0 搜索引物
① Primer Length 我常设置在 18 － 30bp, 短了特异性不好，长了没有必要。当然有特殊要求的除外，如加个酶切位点什么的。
② PCR Product size 最好是 100 － 500bp 之间，小于 100bp 的 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳出来，条带很模糊，不好看。至于上限倒也不必要求苛刻。
③ Search parameters 还是选 Manual 吧， Search stringency 应选 High ， GC 含量一般是 40 － 60 ％。其它参数默认就可以了。
④ 搜索出来的引物，按 Rating 排序，逐个送 Oligo 软件里评估。当然，搜索出的引物，其扩增产物很短，你可以不选择它，或是引物 3 端 ≥2 个 A 或 T, 或引物内部连续的 G 或 C 太多，或引物 3 端 ≥2 个 G 或 C ，这样的引物应作为次选，没得选了就选它。对于这样的引物，如果其它各项指标还可以，我喜欢在引物末端去掉一个不满意的或加上一个碱基，看看引物的评估参数有没有变好点。
2 、 Oligo 6.0 评估引物
① 在 analyze 里， Duplex Formation 不管是上游引物、下游引物还是上下游引物之间， The most stable 3’ -Dimer 绝对值应小于 4.5kcal/mol, The most stable Dimer overall 绝对值一般应小于多少 kcal/mol 跟 PCR 退火温度有关，我几次实验感觉在 PCR 退火温度在 65° 的时候， The most stable Dimer overall 6.7kcal/mol 没有问题。
② Hairpin Formation 根据黄金法则
③ False priming sites: Primer 的 priming efficiency 应该是错配地方的 4 倍左右，更多当然更好。
④ 在 PCR 栏，设计者感觉其所显示的 optimal annealing temperature 数值值得参考。在 PCR 摸索条件的时候，退火温度为其数值加减 2 的范围就可以了。
⑤ Internal stability 很重要：我们希望引物的内部稳定性是中间高、两边低的弧形，最起码保证 3 端不要过于稳定。 下图引物 3 端过于稳定，很容易导致不适当扩增。 △ G 参照黄金法则，这其实很好理解：把一滴水放到大海里，这滴水就会不停的扩散分布，扩散的越厉害越稳定，所以 △ G 绝对值越大结构越稳定。
3 、其他
① 两个评价系统不一样，丁香园战友感觉 oligo 评价引物好点， primer 出来的引物，一般按效率排序，再结合退火温度和引物长度，选择引物到 oligo 测试。这是初步的选择，其实引物到了 oligo 里，退火温度也不一样。
② 3 端的二聚体应该避免，这个要看退火温度决定，一个 50° 的退火温度肯定和 65° 对二聚体的影响不一样了，一般来讲尽量控制在－ 4.5kcal/mol 以下（丁香园战友观点，很多东西真得还是需要自己摸索）。
③我们 感觉 3 端有 A 无 A 影响不大， 3 端有 T 是不是一定不行，不见得。软件是评估，法则也不是没有例外，不是 1 ＋ 1 ＝ 2 那么确定。
④ 错配和二聚体谁轻谁重，丁香园战友觉得 “ 到致命的程度 ” 谁都重要，在设计的时候，尽量两个都不得罪。
⑤ GC 含量并非不重要，它直接影响引物各端稳定性， 3 端来两个 G 或 C, 稳定性就上去了，粘在模板上很牢。所以设计引物的时候，会尽量避免这样的情况出现。
