秋秋欣欣
首先是考虑模板是否有问题
其次考虑引物是否设计有问题
最后考虑是否是酶保存不当而失效了
whilt-shirt
有可能是基因组降解了,建议重新提取试试
未来9
通常如果片段长度很长,扩增失败有可能是因为超出了聚合酶的合成能力。所以也需要看你要扩增的片段,是否在你的扩增酶能力范围之内。如果片段特别长,建议使用长片段扩增酶。
另外,延伸时间是否充分。本来要合长片段就需要延伸时间足够长。建议根据长片段扩增酶的说明书进行PCR条件设定。
当然,最基本的是首先需要确定在样品中有目标片段,很多长片段扩增的时候,是预计有这么长,但实际样品中的情况不同。所以如果有扩增得到短的片段,也建议测序看看,扩增得到的是什么,再判断。
飞来1988
核酸问题:基因组DNA降解,纯化的核酸内存在pcr抑制剂,核酸浓度过低,
引物设计问题:引物设计错误,引物特异性不好,片段过长,建议分段扩增
Pcr程序问题:不是最适退火温度,延伸时间过短,没有使用适合长片段扩增的聚合酶,核酸变性不完全或二级结构复杂,引物结合不上去
Pcr体系问题:dntp,buffer,引物,模板等组份加入量不适合,需要进行优化
汤姆卜丽波
应该就是引物的问题吧,引物不行,
bamboopiggy
可能是你需要扩增的那一段,结构比较复杂,你可以考虑多片段克隆,然后拼接。
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