【求助】转染后Western不出结果可能会有什么原因
丁香园论坛
3555
我刚做的瞬转，转染效率在80%，希望通过Western看一下表达结果（应该为高表达），有未转染的细胞（应有这种蛋白）作对照。
结果未转染的细胞有表达，转染的细胞都没有表达，且ß-actin均有表达。
求助各位高手，可能有什么原因，非常感谢
结果未转染的细胞有表达，转染的细胞都没有表达，且ß-actin均有表达。
求助各位高手，可能有什么原因，非常感谢
上样的总蛋白已经定量过了？
每个样做了几个复孔？
这个试验重复了几次？
该蛋白是否本底表达水平过高？
每个样做了几个复孔？
这个试验重复了几次？
该蛋白是否本底表达水平过高？
上样蛋白为四个孔，为两个样分别有两个复孔，每孔定量为20ug，重复了两次。
最后一个问题没看懂，谢谢！！
最后一个问题没看懂，谢谢！！
未转染的细胞有表达，转染的细胞都没有表达?
你是不是把样品搞混了
你是不是把样品搞混了
未转染细胞应该有表达，转染后应该为高表达。
sissiwubing wrote:
我刚做的瞬转，转染效率在80%，希望通过Western看一下表达结果（应该为高表达），有未转染的细胞（应有这种蛋白）作对照。
结果未转染的细胞有表达，转染的细胞都没有表达，且ß-actin均有表达。
求助各位高手，可能有什么原因，非常感谢
怎么听上去像siRNA or shRNA的转染结果，你确定你用的质粒是正确无误的？
质粒肯定是没问题的。
你的那个转染效率80％怎么得到的。转染的效果主要看标签蛋白的表达情况，然后再看目的基因，你没有提供标签蛋白的表达情况，这种结果只能凭空猜想了
不建议推荐此贴。
楼主根本没把事情完全说清楚，而且我觉的实验设计还稍有问题
1.转染的时候，为何没有空载体的转染？
2.转染后的80%效率是如何算出来的？标签蛋白是什么？一般来说是GFP，那在荧光显微镜下能看到绿色荧光吗？
3.建议先做real time PCR，从RNA水平鉴定有没有转染？如果有空载体，那很容易对比出来。
4.你说质粒绝对无问题，如何能肯定？如果在移码突变，那就表达不了。
5.综合来看：你的实验设计不妥，没有空载体；其次，怎么会没有标签蛋白的？real time有检测过吗？
最后，你的表述很不清楚。发的贴子是让大家来猜你的错误。
所以推荐此贴意义不大。大家都在瞎猜中
楼主根本没把事情完全说清楚，而且我觉的实验设计还稍有问题
1.转染的时候，为何没有空载体的转染？
2.转染后的80%效率是如何算出来的？标签蛋白是什么？一般来说是GFP，那在荧光显微镜下能看到绿色荧光吗？
3.建议先做real time PCR，从RNA水平鉴定有没有转染？如果有空载体，那很容易对比出来。
4.你说质粒绝对无问题，如何能肯定？如果在移码突变，那就表达不了。
5.综合来看：你的实验设计不妥，没有空载体；其次，怎么会没有标签蛋白的？real time有检测过吗？
最后，你的表述很不清楚。发的贴子是让大家来猜你的错误。
所以推荐此贴意义不大。大家都在瞎猜中
zjubell wrote:
不建议推荐此贴。
楼主根本没把事情完全说清楚，而且我觉的实验设计还稍有问题
1.转染的时候，为何没有空载体的转染？
2.转染后的80%效率是如何算出来的？标签蛋白是什么？一般来说是GFP，那在荧光显微镜下能看到绿色荧光吗？
3.建议先做real time PCR，从RNA水平鉴定有没有转染？如果有空载体，那很容易对比出来。
4.你说质粒绝对无问题，如何能肯定？如果在移码突变，那就表达不了。
5.综合来看：你的实验设计不妥，没有空载体；其次，怎么会没有标签蛋白的？real time有检测过吗？
最后，你的表述很不清楚。发的贴子是让大家来猜你的错误。
所以推荐此贴意义不大。大家都在瞎猜中
严重同意！！楼上高手啊！
本文由丁香园论坛提供，想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实验方法的你，都可以成为师兄的好伙伴
师兄微信号：shixiongcoming
