【求助】转染后Western不出结果可能会有什么原因
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我刚做的瞬转,转染效率在80%,希望通过Western看一下表达结果(应该为高表达),有未转染的细胞(应有这种蛋白)作对照。
结果未转染的细胞有表达,转染的细胞都没有表达,且ß-actin均有表达。
求助各位高手,可能有什么原因,非常感谢
结果未转染的细胞有表达,转染的细胞都没有表达,且ß-actin均有表达。
求助各位高手,可能有什么原因,非常感谢
上样的总蛋白已经定量过了?
每个样做了几个复孔?
这个试验重复了几次?
该蛋白是否本底表达水平过高?
每个样做了几个复孔?
这个试验重复了几次?
该蛋白是否本底表达水平过高?
上样蛋白为四个孔,为两个样分别有两个复孔,每孔定量为20ug,重复了两次。
最后一个问题没看懂,谢谢!!
最后一个问题没看懂,谢谢!!
未转染的细胞有表达,转染的细胞都没有表达?
你是不是把样品搞混了
你是不是把样品搞混了
未转染细胞应该有表达,转染后应该为高表达。
sissiwubing wrote:
我刚做的瞬转,转染效率在80%,希望通过Western看一下表达结果(应该为高表达),有未转染的细胞(应有这种蛋白)作对照。
结果未转染的细胞有表达,转染的细胞都没有表达,且ß-actin均有表达。
求助各位高手,可能有什么原因,非常感谢
怎么听上去像siRNA or shRNA的转染结果,你确定你用的质粒是正确无误的?
质粒肯定是没问题的。
你的那个转染效率80%怎么得到的。转染的效果主要看标签蛋白的表达情况,然后再看目的基因,你没有提供标签蛋白的表达情况,这种结果只能凭空猜想了
不建议推荐此贴。
楼主根本没把事情完全说清楚,而且我觉的实验设计还稍有问题
1.转染的时候,为何没有空载体的转染?
2.转染后的80%效率是如何算出来的?标签蛋白是什么?一般来说是GFP,那在荧光显微镜下能看到绿色荧光吗?
3.建议先做real time PCR,从RNA水平鉴定有没有转染?如果有空载体,那很容易对比出来。
4.你说质粒绝对无问题,如何能肯定?如果在移码突变,那就表达不了。
5.综合来看:你的实验设计不妥,没有空载体;其次,怎么会没有标签蛋白的?real time有检测过吗?
最后,你的表述很不清楚。发的贴子是让大家来猜你的错误。
所以推荐此贴意义不大。大家都在瞎猜中
楼主根本没把事情完全说清楚,而且我觉的实验设计还稍有问题
1.转染的时候,为何没有空载体的转染?
2.转染后的80%效率是如何算出来的?标签蛋白是什么?一般来说是GFP,那在荧光显微镜下能看到绿色荧光吗?
3.建议先做real time PCR,从RNA水平鉴定有没有转染?如果有空载体,那很容易对比出来。
4.你说质粒绝对无问题,如何能肯定?如果在移码突变,那就表达不了。
5.综合来看:你的实验设计不妥,没有空载体;其次,怎么会没有标签蛋白的?real time有检测过吗?
最后,你的表述很不清楚。发的贴子是让大家来猜你的错误。
所以推荐此贴意义不大。大家都在瞎猜中
zjubell wrote:
不建议推荐此贴。
楼主根本没把事情完全说清楚,而且我觉的实验设计还稍有问题
1.转染的时候,为何没有空载体的转染?
2.转染后的80%效率是如何算出来的?标签蛋白是什么?一般来说是GFP,那在荧光显微镜下能看到绿色荧光吗?
3.建议先做real time PCR,从RNA水平鉴定有没有转染?如果有空载体,那很容易对比出来。
4.你说质粒绝对无问题,如何能肯定?如果在移码突变,那就表达不了。
5.综合来看:你的实验设计不妥,没有空载体;其次,怎么会没有标签蛋白的?real time有检测过吗?
最后,你的表述很不清楚。发的贴子是让大家来猜你的错误。
所以推荐此贴意义不大。大家都在瞎猜中
严重同意!!楼上高手啊!
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