可重复性差，溶解曲线不一致

向版主及各位高手求教。我是新手做qPCR，但普通PCR做过很多次。可是不知道为什么qPCR 结果出来却是极其的糟糕，扩增曲线呈锯齿状，当然也有少数平滑的，多数都很丑，有的甚至断掉了。溶解曲线呢有的有峰，有的有多个峰，有的峰是倒置的。重复了很多次都是这个结果，而且三个重复孔间Ct值差别很大。真是郁闷。我的操作及反应体系如下。25微升反应体系。 SYBE Green 12.5 微升 Forward Primer(10微摩） 0.5 微升 Reverse Primer(10微摩） 0.5微升 DDW 10.5 微升 cDNA (2微克RNA 反转录后 1：10 稀释加1微升）RNA quality is good 260/280=2.02 260/230=2.14 3个重复孔 一般是准备4个孔的东西全部混在一起，然后每个孔加25微升。 所有的都是这样做的，可是溶解曲线和扩增曲线就那个样子，重复了很多次,都是一个结果。恳请各位帮忙分析一下。