如何在质粒中添加一个新的酶切位点？使用双酶切？保护碱基如何添加，是否考虑移码突变？

在质粒中添加新的酶切位点,可以考虑使用双酶切的方法:

1. 设计引物,使其包含希望添加的酶切位点序列。例如要添加一个XhoI位点,引物中的序列可以是5’-CCGCTCGAGGG-3’。

2. 使用引物对模板DNA进行PCR扩增,得到包含额外酶切位点的DNA片段。

3. 将PCR产物和质粒进行双酶切,利用所添加的酶切位点(如XhoI)和质粒上的另一个酶切位点(如EcoRI),让二者形成互补的粘性末端。

4. 将酶切的PCR产物和质粒连接,重组形成新的复性质粒。

在设计引物时,要注意保护该酶切位点序列两侧的碱基,避免酶切的时候这一序列被切断。同时要考虑阅读框的改变,检查添加的酶切位点是否会导致移码突变。如果导致移码,可以在引物中加入或删除一个或几个碱基,使阅读框保持不变。

综上,双酶切可以方便地在质粒的指定位置插入目标基因或元件,只需要设计好引物并检查移码突变即可。

要选择两个酶切位点，注意尽量避免使用切出平末端的酶。重组引物设计时首先要确定选择的两个酶在的酶切位点在质粒的多克隆位点上的排列顺序，这个不能错，不然序列就会接反。一般设计重组引物的时候，在上游引物5’端前面加上载体多克隆位点排列在前面的酶切位点序列，在下游引物5‘端前面则加上后面的一个酶切位点，酶切位点加好后，注意5’端还需要加上保护碱基，这个具体可以去查下内切酶的说明书。然后要注意，根据载体需要，是否要在引物上带上启动子和终止子。

当在引物5’端添加酶切位点时要考虑:

1.该目的序列内部不得含有相同的酶切位点。

2.如果打算PCR后直接酶切，不要忘了在酶切位点的外侧再加上保护碱基，不同的酶对于保护碱基的要求是不同的。

3.添加保护碱基，需要考虑两个因素:一是碱基数目，一是碱基种类。

添加保护碱基时，应该注意保护碱基的数目。

一般情况下，普通的内切酶只加入两个保护碱基，其内切反应就可以正常进行:而有一类，仅仅只加入两个保护碱基，其内切反应就不能正常进行，这是因为内切酶不能正常结合DNA段上。如Ndel就属这类，需要加入至少6个保护碱基，常用的 HindIIl也要三个。

添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加G或C，反之亦反。

实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助(比如在多接头上切割位点很接近时)，或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。

如果是在PCR产物两端加上酶切位点，则可以在正向与反向引物的5撇端加上，加啥碱基，就要看你要加的酶所识别的碱基序列，然后在再酶切位点前加上2-3个保护碱基，保护碱基也是根据不同的酶加不同的保护碱基，这些你都可以在网上搜索到的。

不管加几个酶切位点都必须在引物的5撇端加，因为引物扩增的方向是从3撇端开始的。正确的引物顺序是 5-XX（保护碱基）+XXX（酶切位点）+引物序列-3。