两步基因置换法

最新修订时间：2024-05-13

材料与仪器

步骤

$常用的第二种基因置换方法是两步法（ Scherer and Davis 1979)。这种方法首先要整合一个含有突变等位基因的质粒，当在目标位点发生整合作用时，将导致这一基因区段的重复----- 个为野生型，另一个为突变型。两者之间含有一段质粒序列，重复的两个拷贝之间的同源交换将导致质粒的切除以及重复区段中两个拷贝之一的丢失。根据交换的准确定位，留下的拷贝要么为突变型，要么为野生型（图 7. 2)。这些拷贝可以通过表型和/或 PCR分析加以区分。若质粒上的可选择标记为URA3 , 则质粒最容易被切除；使用 5-氟-乳清酸（5-F0 A ) 培养基可以挑选出丢失质粒的菌株。 Yip载体染色体 URA3 YFG1 \ i------------ 1 YFG1 yfg1-1 图 7. 2 两步基因置换法两步基因置换法在下列两种情况下使用： 1 ) 如果目标突变没有可选择的表型，则不能使用一步法直接进行筛选。一种特殊基因的温度敏感等位基因置换就属这种情况。使用两步法，能够筛选出含有突变等位基因的凸环质粒的重组子。 2 ) 使用两步法，从相同的起始转化子菌株中能产生野生型和突变型菌株。这样就能提供除目标基因之外的其他基因纯合的菌株。两步基因置换法在实验九中将用于 MAT2 基因座接合型等位基因的转换。通过单交换使质粒整合到染色体导致Y F G J基因座重复，一个拷贝含有野生型 Y F G J基因，另一个拷贝含有:y/g t ] 突变。使用 5-F0 A 培养基可筛选切除质粒的菌株。根据交换体的定位，留下的切除子（ excision) 要么是YFG] ，要么是j /gJ-J$

来源：丁香实验