DNA Poll down实验哪位大神做过

PCR反应中的dUTP标记混合物是biotin-11-dUTP

DNA pull down是一种研究DNA与蛋白互作的方法。其原理是：生物素标记的DNA 片段结合在链霉亲和素磁珠上，再与核蛋白孵育，从而捕获并纯化出与DNA 片段互作的蛋白。

操作步骤：

1.探针制备：

a.对于研究的启动子靶标区域比较明确，且长度较短的DNA片段，可以直接合成并标记上生物素作为pull down探针。

b.对于研究的启动子靶标区域没具体预测区域，一般针对基因上游2000bp序列设计引物，并标记上生物素；然后通过PCR扩增的方式钓取基因上游2000bp序列，回收纯化后作为DNA pull down的探针。

2.样本前处理

a. 用1ml Cell lysis buffer重悬（10^7细胞）;冰上孵育10min，（5000g，4°，5min）离心，弃上清。

b. 加入2/3细胞体积的 Buffer B 悬浮细胞，超声5s裂解细胞。4℃，10,400× g for 5 min离心5min；取上清。

c. 用Buffer D稀释步骤b的上清液，-80℃冻存备用

3.Dynabead™ MyOne™ 链霉素亲和素 C1预处理：

a. 涡旋震荡磁珠40s，混匀磁珠

b. 分装60ul磁珠的1.5mL离心管中；

c. 磁力架上放置1min，弃上清；

d. 用1mL1X B&W Buffer洗涤磁珠3遍;

e. 用60ul2X B&W Buffer悬浮磁珠；

f. 加入60 pmol生物素标记DNA（1ｕｇ）;室温颠倒孵育15 min;

g. 磁力架上放置3min,去上清

h. 用60 μL 1X B&W Buffer　洗涤3遍；

i. 用60ul 1× B/W buffer（ without NaCl）洗涤一遍

4.DNA pull down

a.制备binding reaction：加入100 µL 5× EMSA buffer 及包含100 µg 核蛋白 的上清液 ；补水至 500 µL.

b. 加500ul binding reaction到磁珠中；常温翻转20min

c.磁力架上放置1min，弃上清；

d.用wash buffer 洗涤3遍。

e.回收产物，进行后续WB验证或质谱鉴定。