4 个回答
汤姆卜丽波
注意事项:
1.秋水仙素的注射剂量与时间对观察中期染色体的形态影响很大。通常情况下,小鼠按4 P g/g体重的剂量经腹腔注射秋水仙素, 3一4h后处死小鼠,此时观察中期染色体特征明显。注射时间过短或过长,在镜下可见间期细胞多,而中期染色体形态少。如果在显微镜下能观察到50%一80%中期染色体,说明试验操作相当成功。2.制样时用装有2%柠檬酸钠溶液的注射器针反复吹洗。此外要防止注射针头阻塞。3.低渗处理是实验成败的关键,其目的是使细胞体积胀大,染色体松散。低渗处理时间过长,会造成细胞破裂,染色体丢失。低渗处理时间不足,细胞内染色体则易聚集在一起,不能很好伸展开来,观察时无法区分和计数。4.固定液要现配现用。用固定液固定染色体形态至关重要,固定时间要充分，应在20min以上。.5.载玻片要事前要酸液浸泡24-48h ,自来水反复冲洗后,双蒸水冲洗后,烘干备用。临用前,用洁净纸包裹置于4度冰箱中。6.对于离心过后的沉淀于管底中的沉淀物,要用吸管吸入固定液将细胞轻轻吸打均匀。尤其最后一步,如果混合不均匀,可造成细胞聚集成团,在镜下就不易见到散在的中期染色体,影响染色体的后期分析。
Eason老歌迷
有很多种原因可能导致。我选择几个点来说。
首先秋水仙素多或处理时间过长，
低低渗过度,细胞会破裂，
离心速度过大或离心时间过长,则会引起细胞破裂。
bamboopiggy
首先看看你的试剂是不是正确？下面是做这个实验的protocol，你看看你有哪一步没有做到
1）细胞培养
细胞正常培养，观察细胞生长状态，接种至 6 孔培养板，培养44-48h。待其生长至对数生长期（融合度 50%～60%）进行实验。
2）秋水仙素处理
吸去培养基，分别加入含有秋水仙素（终浓度0.3ug/ml）的新鲜培养基，继续于 37℃ 培养 3小时。培养结束后，常规消化细胞，离心去上清液，重悬细胞并轻轻吹散均匀。
3）低渗处理
逐滴滴加预热（提前进行37度 水浴）的 3 mL 低渗液，并将细胞均匀分布于悬液中，再逐滴滴加5ml低渗液，轻轻颠倒离心管至水平 2 次，放至 37 ℃ 水浴作用 15 分钟。
4）预固定
加入新鲜配制的固定液约 200 μL，预固定 2 分钟；1000 rpm 离心 8 分钟。
5）固定
A．去上清，敲打管底以剩余溶液使细胞充分重悬，确保细胞成单个分散状态；B．沿管壁逐滴滴加 3 mL 固定液，用枪轻轻将细胞吹散，再逐滴加入 5 - 8 mL 固定液，4℃冰箱固定30 min；C．1000 rpm 离心 8 分钟，敲打管底使细胞充分重悬，确保细胞成单个分散状态。如上述加入固定液重复固定细胞 2 次；D．剩余 0.3ml 固定液，用枪轻轻吹散细胞。
6）制片
吸取细胞悬液，滴至预冷的载玻片上，将载玻片掠过酒精灯几次，室温下干燥。在显微镜下观察，滴加的悬液不能重叠。哺乳动物细胞悬浮液滴加高度为距载玻片20cm。哺乳动物细胞悬浮液滴加时，载玻片与水平面成15°角。优选地， 哺乳动物细胞悬浮液的滴加量为每载玻片10 μ L。
7）染色
取出玻片，滴加稀释后的 Giemsa 液，完成覆盖即可，染色 25分钟；自来水冲洗终止染色，放入 37 ℃ 烘干。
8）封片
以封片剂封片，以备长期保存。
9）镜检观察
10）先用低倍镜做全面检查，再换至高倍镜，以100X油镜观察并拍照。
天一湖医者
1)动物的选择,一般用小鼠,其繁殖能力强,易于饲养.我们常用的是它们的骨髓细胞和精巢,因其分裂指数较高,不用体外培养就可以得到分裂中期的细胞.
2)秋水仙素用量要注意,太多或处理时间过长,会导致染色体的过分凝缩或着丝点裂解,最终会引起染色体形态不正常,甚至被破坏或溶解.
3) 低渗处理很关键.低渗液的量、处理时间均与细胞的数量有关.低渗过度,细胞会破裂；低渗不足则染色体在一起,分散不开.
4) 离心速度或离心时间也能影响染色体标本的制备.离心速度过大或离心时间过长,则会引起细胞破裂；反之,离心速度过小或离心时间过短,则细胞沉降不下来,则会引起大量细胞的丢失.
5) 固定液要随用随配,固定彻底后再打散细胞团块,否则细胞容易破碎,染色体分散亦受到影响.
6) 载玻片要预冷.冷却不够,则会影响染色体的附着和铺展.
7) 用吸管吹散细胞时用力必须尽量轻柔,用力过大则会造成细胞破裂,而染色体也会弥散在溶液中,在随后的离心中将会丢失.
8) 滴片时的高度很重要,高度过低细胞不会破裂；过高则染色体过于分散甚至丢失,无法辨别出染色体的准确数量.
