质粒怎么都提不出来，该用哪种方法？

美少女金

2013-01-25

最近从国外要了一个大肠和分支杆菌的穿梭质粒，先转大肠杆菌保存，然后提取质粒没问题，然后转进分枝杆菌，可以筛选得到转化子，但是用碱法提质粒确提不出来，也试过用溶菌酶作用，都不行。发信给作者，证明这个质粒非整合性质粒，但拷贝数较低，采用大量提取也不行，而且每次都会把染色体DNA提出来，现在不知道怎么办？不知哪位能给出一个快速鉴定的好办法？

1 个回答

琴琴小贝

2013-01-25

有帮助

分支杆菌中的质粒提取：采用经典的碱裂解法。取4.5 mlEP管一支，加0.5 ml菌液，加入1 ml溶液1（15％蔗糖、25 mMTriscl pH8.0、10 mMEDTA pH8.0)，隔时加入溶菌酶，终浓度10 mg/ml，小心混匀。置于0度冰浴30 min，加入2 ml溶菌液2（0.2NNao 1%SDS）,0度冰浴10 min，加1.5 ml 3M NaAC小心混匀。1 000 rpm离心10 min，取上清转至另一EP管终，加入0.6倍体积异丙醇，置－20度过夜。15 000 rpm离心15 min，小心弃上清液，管底沉淀用70％乙醇洗两次，凉干。加入适量TE缓冲液融解。查到文献一篇，可供参考：（不好意思，文献太大不好上传，你上中国期刊网查一下篇名为《分枝杆菌质粒的提取》94年中国微生态学杂志）另外，曲拉通X-100是属于非离子型表面活性剂。