【求助】差异基因表达的分析方法：哪种比较好？
丁香园论坛
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最近有个实验要做，但是不知道用哪种方法较好。
实验目的：检测80个已知其序列的基因在肺癌细胞系的肿瘤干细胞和非肿瘤干细胞中的表达差异。
用哪种方法比较可靠，而且省钱，大约需要多少经费和时间。
下面这些方法那些可以用？有没有其他方法？
1. 基因表达指纹（ gene expression fingerprinting， gEF.
2．基因表达系统分析（ serial analysis of gene expression， sAGE）.
3. cDNA3′端限制酶切片段显示（ display of 3′ end restriction fragments of cDNAs.
4. 分子指数的 rNA指纹（ rNA fingerprinting by molecular indexing， mI）.
5. 抑制性消减杂交（ suppression subtractive hybridization， sSH）.
非常感谢
实验目的：检测80个已知其序列的基因在肺癌细胞系的肿瘤干细胞和非肿瘤干细胞中的表达差异。
用哪种方法比较可靠，而且省钱，大约需要多少经费和时间。
下面这些方法那些可以用？有没有其他方法？
1. 基因表达指纹（ gene expression fingerprinting， gEF.
2．基因表达系统分析（ serial analysis of gene expression， sAGE）.
3. cDNA3′端限制酶切片段显示（ display of 3′ end restriction fragments of cDNAs.
4. 分子指数的 rNA指纹（ rNA fingerprinting by molecular indexing， mI）.
5. 抑制性消减杂交（ suppression subtractive hybridization， sSH）.
非常感谢
版主freecell留言:
不错的讨论。作为版主，本人非常欣赏这样的讨论气氛。
感谢进来参与讨论的战友。新年快乐。
不错的讨论。作为版主，本人非常欣赏这样的讨论气氛。
感谢进来参与讨论的战友。新年快乐。
楼主不知是否看了Science上这篇文献，被引用了1107次。我建议你看看这篇文献的思路，以及”最近几年内，引用此文的文献“。
Gene Expression Profiles in Normal and Cancer Cells
http://www.sciencemag.org/cgi/content/abstract/276/5316/1268
另Nature上的此文，也被引用了1300次之多，足可借鉴：
Systematic variation in gene expression patterns in human cancer cell lines
http://www.princeton.edu/genomics/botstein/publications/2000_Ross_Systematic.pdf
Gene Expression Profiles in Normal and Cancer Cells
http://www.sciencemag.org/cgi/content/abstract/276/5316/1268
另Nature上的此文，也被引用了1300次之多，足可借鉴：
Systematic variation in gene expression patterns in human cancer cell lines
http://www.princeton.edu/genomics/botstein/publications/2000_Ross_Systematic.pdf
freecell wrote:
楼主不知是否看了Science上这篇文献，被引用了1107次。我建议你看看这篇文献的思路，以及”最近几年内，引用此文的文献“。
Gene Expression Profiles in Normal and Cancer Cells
http://www.sciencemag.org/cgi/content/abstract/276/5316/1268
非常感谢，但是我只检测这些已知的80个基因，似乎不需要哪种大样本的检测，再次感谢。
cypress1975 wrote:
最近有个实验要做，但是不知道用哪种方法较好。
实验目的：检测80个已知其序列的基因在肺癌细胞系的肿瘤干细胞和非肿瘤干细胞中的表达差异。
用哪种方法比较可靠，而且省钱，大约需要多少经费和时间。
下面这些方法那些可以用？有没有其他方法？
1. 基因表达指纹（ gene expression fingerprinting， gEF.
2．基因表达系统分析（ serial analysis of gene expression， sAGE）.
3. cDNA3′端限制酶切片段显示（ display of 3′ end restriction fragments of cDNAs.
4. 分子指数的 rNA指纹（ rNA fingerprinting by molecular indexing， mI）.
5. 抑制性消减杂交（ suppression subtractive hybridization， sSH）.
非常感谢
1、我感觉你把问题考虑的复杂化了。
2、你说的那些通量高的基因表达差异分析方法，其结果都必须再用定量PCR验证，费用要高。
3、因此，鉴于你只检测80个基因，我认为直接就用SYBR GREEN定量PCR即可，费用反而要低、不用花冤枉钱。
所以说，实验方法要选择最合适的，而不是最贵最先进的。
buyqcn wrote:
1、我感觉你把问题考虑的复杂化了。
2、你说的那些通量高的基因表达差异分析方法，其结果都必须再用定量PCR验证，费用要高。
3、因此，鉴于你只检测80个基因，我认为直接就用SYBR GREEN定量PCR即可，费用反而要低、不用花冤枉钱。
所以说，实验方法要选择最合适的，而不是最贵最先进的。
太感谢你的帮助了，不知道这大约需要多少经费，另外，如果将这80个基因全部克隆于带有绿色荧光蛋白的载体中，大约需要多少经费，非常感谢。
cypress1975 wrote:
太感谢你的帮助了，不知道这大约需要多少经费，另外，如果将这80个基因全部克隆于带有绿色荧光蛋白的载体中，大约需要多少经费，非常感谢。
1、基因表达检测部分，理论上计算，按照你说的2个样品，80个基因，每个基因重复3次，一共需做480次定量PCR，即5个100次的试剂盒，5000-10000元。另外，每个基因的引物合成约150元，80个基因共12000元。所以共计2万左右。但真正做下来，估计至少3万。
2、基因表达部分，80个基因全部克隆，这个费用不太好算，要看基因了，商业公司卖的价格300-1000美元/克隆。常规基因克隆，做的越多，成本也就越低；我们经常做，但没有仔细算过，克隆的步骤也多，如果只算引物合成+试剂+测序成本的话，均摊下来的话我估计1000元一个克隆吧。
3、因为你做的是表达克隆，所以还必须做WB验证，需要购买抗体和WB试剂，这是另一笔费用。如果蛋白表达了，还要看蛋白定位、活性等等，又是一笔费用。
4、基因克隆虽不像初学者所说的那么难，但也不是像半瓶子水的研究者认为的那么简单，根据我的经验，两类基因的克隆有点难度：低丰度的基因难克隆；分子量大的难克隆（尤其是100KD以上，这时其ORF超过3000bp，做高保真PCR有难度。注：基金申请中，有时看到申请者人无意识的选做的恰就是大分子量蛋白，可谓不知者者无畏）。
5、但事实上真正的困难还是在于基因的外源表达和功能/活性等后续检测。
所以，建议你先做基因表达检测，然后选择性的再做基因克隆表达。
基因的差异表达分两步，一是通过mRNA的变化来考察基因转录的改变，这部分用RealTimePCR或者SSH可以做到，第二是检查，蛋白表达量的变化来考察蛋白翻译的改变，这部分可用2D加细胞ELISA来做。
有两种思路，一种即楼上提及的将80个基因分别进行定量PCR，以得到这80个基因的差异表达结果；另一种是先做SSH，将肿瘤干细胞和非肿瘤干细胞之间的差异表达基因找出来，再通过比对，看这80个基因里面有多少，通过RealTimePCR进一步定量分析。毕竟这80个基因有差异表达的可能只有一小部分，而同时SSH也可以找到这80个基因之外的差异表达基因。
关于克隆表达，我有点疑问。如果这80个基因全部到肿瘤干细胞和非肿瘤干细胞中做克隆表达，那么会实验目的发生偏差，毕竟你的实验目的是“检测80个已知其序列的基因在肺癌细胞系的肿瘤干细胞和非肿瘤干细胞中的表达差异”。
如果这80个基因克隆到表达株（原核，真核）去表达，那么走的是蛋白的外源表达及体外活性（功能）检测。
如果这80个基因分别克隆到肿瘤干细胞和非肿瘤干细胞中去，通过tag（或其他辅助蛋白如GFP等）检测其表达差异，那么其结果就不是“80个已知其序列的基因在肺癌细胞系的肿瘤干细胞和非肿瘤干细胞中的表达差异”，而变成了“80个基因在肺癌细胞系的肿瘤干细胞克隆株和非肿瘤干细胞克隆株中的表达差异”。
所以检测80个已知其序列的基因在肺癌细胞系的肿瘤干细胞和非肿瘤干细胞中的表达差异，就需要这80个基因的表达产物有所研究，最直接的方法是购买其蛋白抗体，对肿瘤干细胞和非肿瘤干细胞分别做细胞ELISA，才能得到蛋白表达水平上的差异结果。
而且这80个基因是全部都要做的，无论其在基因水平上面是否有差异，因为有可能出现基因表达没有差异，但蛋白表达有差异的情况，即基因转录没有受到影响但是蛋白翻译受到影响的情况。
当然，可能的话也可以在这之前做一个2D-PAGE，将所有差异表达的蛋白找出来，同样可以鉴定差异蛋白是否在这80个基因之中。
有两种思路，一种即楼上提及的将80个基因分别进行定量PCR，以得到这80个基因的差异表达结果；另一种是先做SSH，将肿瘤干细胞和非肿瘤干细胞之间的差异表达基因找出来，再通过比对，看这80个基因里面有多少，通过RealTimePCR进一步定量分析。毕竟这80个基因有差异表达的可能只有一小部分，而同时SSH也可以找到这80个基因之外的差异表达基因。
关于克隆表达，我有点疑问。如果这80个基因全部到肿瘤干细胞和非肿瘤干细胞中做克隆表达，那么会实验目的发生偏差，毕竟你的实验目的是“检测80个已知其序列的基因在肺癌细胞系的肿瘤干细胞和非肿瘤干细胞中的表达差异”。
如果这80个基因克隆到表达株（原核，真核）去表达，那么走的是蛋白的外源表达及体外活性（功能）检测。
如果这80个基因分别克隆到肿瘤干细胞和非肿瘤干细胞中去，通过tag（或其他辅助蛋白如GFP等）检测其表达差异，那么其结果就不是“80个已知其序列的基因在肺癌细胞系的肿瘤干细胞和非肿瘤干细胞中的表达差异”，而变成了“80个基因在肺癌细胞系的肿瘤干细胞克隆株和非肿瘤干细胞克隆株中的表达差异”。
所以检测80个已知其序列的基因在肺癌细胞系的肿瘤干细胞和非肿瘤干细胞中的表达差异，就需要这80个基因的表达产物有所研究，最直接的方法是购买其蛋白抗体，对肿瘤干细胞和非肿瘤干细胞分别做细胞ELISA，才能得到蛋白表达水平上的差异结果。
而且这80个基因是全部都要做的，无论其在基因水平上面是否有差异，因为有可能出现基因表达没有差异，但蛋白表达有差异的情况，即基因转录没有受到影响但是蛋白翻译受到影响的情况。
当然，可能的话也可以在这之前做一个2D-PAGE，将所有差异表达的蛋白找出来，同样可以鉴定差异蛋白是否在这80个基因之中。
buyqcn wrote:
1、基因表达检测部分，理论上计算，按照你说的2个样品，80个基因，每个基因重复3次，一共需做480次定量PCR，即5个100次的试剂盒，5000-10000元。另外，每个基因的引物合成约150元，80个基因共12000元。所以共计2万左右。但真正做下来，估计至少3万。
2、基因表达部分，80个基因全部克隆，这个费用不太好算，要看基因了，商业公司卖的价格300-1000美元/克隆。常规基因克隆，做的越多，成本也就越低；我们经常做，但没有仔细算过，克隆的步骤也多，如果只算引物合成+试剂+测序成本的话，均摊下来的话我估计1000元一个克隆吧。
3、因为你做的是表达克隆，所以还必须做WB验证，需要购买抗体和WB试剂，这是另一笔费用。如果蛋白表达了，还要看蛋白定位、活性等等，又是一笔费用。
4、基因克隆虽不像初学者所说的那么难，但也不是像半瓶子水的研究者认为的那么简单，根据我的经验，两类基因的克隆有点难度：低丰度的基因难克隆；分子量大的难克隆（尤其是100KD以上，这时其ORF超过3000bp，做高保真PCR有难度。注：基金申请中，有时看到申请者人无意识的选做的恰就是大分子量蛋白，可谓不知者者无畏）。
5、但事实上真正的困难还是在于基因的外源表达和功能/活性等后续检测。
所以，建议你先做基因表达检测，然后选择性的再做基因克隆表达。
首先非常感谢这么细致的回复。
我想知道，基因克隆到绿色阳光蛋白载体中，转染细胞后，是否在细胞中看到绿色荧光蛋白就可以认为目的蛋白表达了，还需要进行抗体检测吗？
阳光海岛 wrote:
基因的差异表达分两步，一是通过mRNA的变化来考察基因转录的改变，这部分用RealTimePCR或者SSH可以做到，第二是检查，蛋白表达量的变化来考察蛋白翻译的改变，这部分可用2D加细胞ELISA来做。
有两种思路，一种即楼上提及的将80个基因分别进行定量PCR，以得到这80个基因的差异表达结果；另一种是先做SSH，将肿瘤干细胞和非肿瘤干细胞之间的差异表达基因找出来，再通过比对，看这80个基因里面有多少，通过RealTimePCR进一步定量分析。毕竟这80个基因有差异表达的可能只有一小部分，而同时SSH也可以找到这80个基因之外的差异表达基因。
关于克隆表达，我有点疑问。如果这80个基因全部到肿瘤干细胞和非肿瘤干细胞中做克隆表达，那么会实验目的发生偏差，毕竟你的实验目的是“检测80个已知其序列的基因在肺癌细胞系的肿瘤干细胞和非肿瘤干细胞中的表达差异”。
如果这80个基因克隆到表达株（原核，真核）去表达，那么走的是蛋白的外源表达及体外活性（功能）检测。
如果这80个基因分别克隆到肿瘤干细胞和非肿瘤干细胞中去，通过tag（或其他辅助蛋白如GFP等）检测其表达差异，那么其结果就不是“80个已知其序列的基因在肺癌细胞系的肿瘤干细胞和非肿瘤干细胞中的表达差异”，而变成了“80个基因在肺癌细胞系的肿瘤干细胞克隆株和非肿瘤干细胞克隆株中的表达差异”。
所以检测80个已知其序列的基因在肺癌细胞系的肿瘤干细胞和非肿瘤干细胞中的表达差异，就需要这80个基因的表达产物有所研究，最直接的方法是购买其蛋白抗体，对肿瘤干细胞和非肿瘤干细胞分别做细胞ELISA，才能得到蛋白表达水平上的差异结果。
而且这80个基因是全部都要做的，无论其在基因水平上面是否有差异，因为有可能出现基因表达没有差异，但蛋白表达有差异的情况，即基因转录没有受到影响但是蛋白翻译受到影响的情况。
当然，可能的话也可以在这之前做一个2D-PAGE，将所有差异表达的蛋白找出来，同样可以鉴定差异蛋白是否在这80个基因之中。
非常感谢，我想知道做2D-PAGE是否必须买抗体？
cypress1975 wrote:
首先非常感谢这么细致的回复。
我想知道，基因克隆到绿色阳光蛋白载体中，转染细胞后，是否在细胞中看到绿色荧光蛋白就可以认为目的蛋白表达了，还需要进行抗体检测吗？
1、你说的克隆至GFP载体中，有两种策略：一是和GFP融合表达；二是和GFP分别单独表达。如果你用第一种方案，当你转染重组载体看到GFP，可以认为“目的蛋白可能也表达”，但还需进一步的检测确认其表达。
2、你在看下我前面的帖子，我说的比较清楚：关键在于后续的蛋白质表达/活性/功能检测等。实际上，无论做什么实验都必须步步为营、逐步推论，让实验结果说话。
3、阳光海岛战友说的2D-PAGE，根据我的经验，尤其对于研究经费不够充裕的研究者，不是上策。举个例子，2D-PAGE出来一个差异条带或点，需要做质谱，然后根据质谱结果再预测候选蛋白，这时一般都会有大量候选蛋白预测出来，后续的WB验证工作也够呛。
4、SSH费用相对低些，但其对操作要求稍高些，我倒是建议你可以试试这个技术。
5、但你要注意一点：不论是SSH和2D-PAGE，可以用来筛选差异基因或蛋白，但均不能用于验证或保证你说的这80个基因的表达是否真的有差异。
cypress1975 wrote:
非常感谢，我想知道做2D-PAGE是否必须买抗体？
2D-PAGE 不需要买抗体，但是做2D-PAGE本身做起来花费不小，而且不是很容易做。而且2D-PAGE只能将差异的蛋白显示出来，但这些蛋白到底是什么，还要做进一步的检测，如buyqcn战友所说的需要做质谱，可能还需要做蛋白质测序，工作也是很大。因此我的帖子里面也只是在最后捎带一提，并不是很推荐。
buyqcn战友上面说的第五点非常好，即SSH和2D-PAGE都是初筛手段，还需要后续验证，而且，对于一个实验结果，也需要从多方面进行验证，其结果才比较可信。
终于明白了，太感谢各位的热心帮助了
对于已知的基因，SSH不是好的策略，难度大，费用高，假阳性率也高。3万元做80个基因的定量PCR，不如应用基因芯片+荧光定量PCR组合更合适，可以做到6份样本（每组设3个生物学重复）的检测。芯片部分约2万元+定量部分1万元。
找几个兄弟帮忙分一下做PCR，你总共只有两种细胞，80个基因一个星期估计就能做完。其他方法其实最终还得要PCR或northern来验证。如果引物设计好了，从你发帖那天到现在说不定已经出结果了，呵呵。做完PCR后，看情况觉得后续研究策略。
第一次看到楼主的问题我就和ebio66站友的想法一样了
综合从花费成本和时间考虑定制芯片是最好的选择了吧
本帖下的讨论真的很精彩啊，拜读ing
综合从花费成本和时间考虑定制芯片是最好的选择了吧
本帖下的讨论真的很精彩啊，拜读ing
chen21gq wrote:
找几个兄弟帮忙分一下做PCR，你总共只有两种细胞，80个基因一个星期估计就能做完。其他方法其实最终还得要PCR或northern来验证。如果引物设计好了，从你发帖那天到现在说不定已经出结果了，呵呵。做完PCR后，看情况觉得后续研究策略。
荧光定量PCR尤其是SYB法不是那么容易就出来的，首先目的基因和内参基因扩增效率一致性就要做很久。我个人觉得定制芯片是可行的。
请问单纯检测同种基因不同来源之间的差别，不需要测到具体的量，是SYB法，能不能不用参照，不做基因的扩增效率，不做标准曲线。
急！
谢谢指教。
急！
谢谢指教。
这个帖子非常好，很受用！最近我也在为做基因的差异表达犯愁。目前有两种选择：一种是做SSH，另一种是做芯片。但从目前了解的费用来看，花费都很高。不知是否有哪位战友以前做过（SSH和芯片）？恳请介绍一下经费成本！谢谢！
受益匪浅~
我想请问一下，我查到一个基因，与细胞的凋亡功能有关，之前有人用ELISA验证过它在白血病的两种细胞株中是表达的，现在我想研究它在白血病发病过程中的作用，是否还是先要验证这个基因在正常人和白血病病人之间的表达差异？用相对定量PCR的方法可以吗？
本文由丁香园论坛提供，想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实验方法的你，都可以成为师兄的好伙伴
师兄微信号：shixiongcoming
