市面上的 ELISA 试剂盒五花八门，质量良莠不齐。如何浪里淘金，选择既符合科研需求，又品质上乘的 ELISA 试剂盒呢?教你七招，快速搞定 ELISA 试剂盒的选择！ 01 查找待测样本的蛋白浓度通过检索 SCI 文献、Genecards、Mayocliniclabs 等，获得目标蛋白的表达部位及表达浓度参考值，比较 ELISA 试剂盒中给出的样本测值与参考值是否一致。 02 明确试剂盒的应用种属＆检测的样本类型不同厂家验证的样本类型不同。除试剂盒特别说明外，一般情况下，不同种属不能通用。常见待测样本类型有：血清、血浆、细胞上清、组织匀浆、细胞裂解液等。实验前，需要判断试剂盒能否满足目标物种的目标蛋白检测。 03 明确试剂盒的检测范围试剂盒的检测范围即标准曲线范围。标准曲线范围不等同于样本浓度范围，所以，要特别注意判断待测样本浓度是否落在标准曲线范围内。对于浓度很高的样本，建议先通过预实验，摸索出合适的稀释倍数后，再大量测定样本。 04 明确试剂盒的国际质控标准1 稀释线性一般指样本稀释线性，即：将样本梯度稀释，看各稀释梯度浓度是否成线性；对于高浓度样本，建议选择 OD 值落在标曲范

整体 OD 值偏高标曲 OD 值正常，样本 OD 值过高标准品/样本复孔差异大空白背景值高

生物素亲和素(又称抗生物素)系统(biotin avidin system,BAS)标记抗体的技术是 20 世纪 70 年代后期发展起来的一种新的免疫检测方法。由于亲和素与生物素间的亲和力极强，结合迅速，且极其稳定，生物素标记抗体和酶的标记率高，又不影响蛋白的活性，使 BAS 标记技术比常规酶联免疫、放射免疫及荧光免疫技术有着更高的灵敏度，为微量抗原、抗体的检测开辟了新的途径。近年来，在 BAS 检测中多用链霉亲和素“streptavidin,SA”，它是链霉菌培养过程中的分泌物，完整的链霉亲和素和从卵白中提取的亲和素一样，也由4条相同的肽链组成。因链霉亲和素在检测应用中发生的非特异性结合远较亲和素低，因此日渐受重视，已有取代亲和素之势。 各种抗体或酶的标记物在国内已有商品供应，使用方便。BAS ELISA 具有的特点：①对于所有的抗原抗体系统，包括免疫细胞化学、ELISA、免疫印迹法等都适用，应用范围极广；②BAS 在温和条件下可与各类生物大分子如蛋白质、脂多糖等结合，并且这种结合对原生物大分子的生物活性无影响；③每个亲和素分子可与 4 个生物素分子结合，所以可以偶合更多连接生物素的

ELISA 实验失败可能由多种因素造成。在实验前阅读并充分了解产品说明书，可以一定程度上避免出现意想不到的结果。参考以下提示来避免实验出现问题。 1. 检查试剂盒的保质期，保证所有试剂按说明书上的建议正确保存；2. 检查试剂溶液是否存在不稳定或降解迹象，如沉淀或变色等；3. 底物溶液应为无色；4. 试剂制备和保存时应使用干净的一次性塑料吸量管、枪头和容器。每次加液（样品、标准品及其他试剂）时，及时更换枪头，避免交叉污染；5. 确保孵育时间和温度与规定的高度一致；6. 盒中试剂不能用其他试剂替代；7. 建议样本和标准品都做复孔，以提高实验结果的准确性。

优质的试剂，良好的仪器和正确的操作是保证 ELISA 检测结果准确可靠的必要条件。ELISA 的操作因固相载体的形成不同而有所差异，国内医学检验一般均用板式点。本文将叙述板式 ELISA 各个操作步骤的注意要点，珠式、管式及磁性球 ELSIA，国外试剂均与特殊仪器配合应用，两者均有详细的使用说明，严格遵照规定操作，必能得出准确的结果。 1. 标本的采取和保存可用作 ELISA 测定的标本十分广泛，体液（如血清）、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液、粪便）等均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。有些标本可直接进行测定（如血清、尿液），有些则需经预处理（如粪便和某些分泌物）。大部分ELISA 检测以血清标本为主。血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外，其他成份均同等于血清。制备血浆标本需借助于抗凝剂，而血清标本只要待血清自然凝固、血块收缩后即可取得。血清标本可按常规方法采集，应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以 HRP 为标记的 ELISA 测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。血清标本宜在新鲜时检测。如有细菌污染，菌体中可能含有内源性 HRP，也会产生假阳性反应

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正确地清洗酶标板是成功完成 ELISA 实验的关键之一。稀释浓缩洗涤液时应使用去离子水或蒸馏水。以下是正确清洗酶标板的注意事项： 使用多通道移液器首先，检查酶标板确保其牢固放置于板架上。随后，翻转酶标板倾倒液体。按照说明书所示体积在每孔加入洗涤液。按照推荐的时间，计时器设置洗涤液浸泡时间。再次翻转酶标板倒出液体，用干净的吸水纸轻拍，将孔内液体拍干。按照说明书建议的次数重复以上步骤。最后一次在吸水纸上拍干后迅速进行下一步操作。避免孔内液体自然风干。 使用多管道分液器或洗板机使用与分液器或洗板机配套的真空泵。确保每个通道的分液管道和吸液管道正常运作。设置每次洗涤时的洗涤液的体积和浸泡时间，随后放入酶标板。确保吸液后没有洗涤液残留在孔内。洗板太快或太慢、洗涤或吸液不完全、孔内液体自然风干等均会影响 ELISA 的精准性。

底物范围较广，包括二氨基联苯胺 (DAB)、氯萘酚和氨乙基咔唑等。 二氨基联苯胺/金属盐DAB 是辣根过氧化物酶最敏感、常用的底物。它产生强烈的棕色产物，在水和醇中不溶解。多数情况下，推荐在 DAB 中加入不同的金属离子。当加入金属盐如钴、镍至底物液中，辣根过氧化物酶可以更加敏感。此类反应产物呈暗蓝灰色至黑色，且在水及醇中稳定。DAB/金属盐染色应用的组织染色范围较广。1. 需要的溶液和特殊设备DAB，0.05 mol/L Tris 缓冲液 (pH7.6), 0.3％ (W/V) 氯化镍/水贮存液, 30％ 过氧化氢, DPX, 光学显微镜(通常带有照相机以便于记录结果).2. 操作步骤(1) 用 9 mL 0.05 mol/L Tris 缓冲液 (pH7.6)溶解 6 mg DAB；(2) 加 l mL 0.3％(W/V)氯化镍/水贮存液(也可以用等量的氯化钴替代)；(3) 加0.1 mL 3％ 过氧化氢。过氧化氢一般以 30％ 的溶液提供，贮存在 4 ℃，此条件可以持续 1 个月；(4) 如果出现沉淀，用滤纸过滤；(5) 加此溶液至标本，并孵育1~20 min 水洗

移液的一致性是实验重复性好的关键。移液时必须保持平稳、一致的速度。吸液和加液时要避免突然挪动移液器。检查移液器枪头，确保其正确安装在移液器末端。加不同的试剂和样品时需更换枪头。加液的体积不能少于说明书上建议的体积，否则会降低实验的准确性和重复性。一些溶液可能容易吸附在枪头的内壁或外壁，用样本或试剂来润洗枪头可降低或避免液体的表面张力，从而提高实验的准确性。针对有黏性的溶液，吸液时需要在溶液中平衡几分钟再取出。如果加液时枪头有气泡产生，则将液体重新注入溶液中，重新缓慢地取液。如果依然有气泡产生，弃去枪头，换新的枪头。不同的溶液使用不同的贮液瓶。

天然免疫是机体抗病毒感染的第一道防线。机体为清除侵入的病毒必须启动有效的天然免疫应答，为避免过度天然免疫反应导致免疫病理损伤和清除入侵的病毒后快速恢复细胞内环境稳态，宿主细胞进化出多样的机制以调控天然免疫应答的强度。2022 年 1 月 4 日，中国医学科学院病原生物学研究所赵振东课题组和王健伟课题组在 Science Signaling 期刊发表题为：ID2 inhibits innate antiviral immunity by blocking TBK1- and IKKε-induced activation of IRF3 的研究论文，并被选为当期期刊封面。宿主细胞通过模式识别受体（PRR）识别病原体核酸、蛋白等分子模式（PMP），激活下游信号通路，通过分子级联反应诱导 I 型干扰素（IFN-I）和 III 型干扰素（IFN-III）的产生，发挥抗病毒作用。其中，TBK1/IKKε-IRF3 信号转导在病毒诱导的天然免疫应答中发挥至关重要的作用。ID2 是一种转录调节分子，属于 ID 蛋白家族成员，主要发挥基因的转录调控作用。ID2 在多种细胞，尤其是免疫细胞的发育和分化中

本周继续为大家带来 CNS 最新科研进展，与各位共赴科学盛宴！ 1. Signal Transduction and Targeted Therapy：基因编辑助力无精男性圆父亲梦 非阻塞性无精症是最严重的男性生殖系统疾病之一，睾丸无法产生功能正常的精子。 2022 年 1 月 3 日，中科院动物研究所高飞研究员等团队在 Signal Transduction and Targeted Therapy 杂志上发表研究论文 Mutations of MSH5 in nonobstructive azoospermia (NOA) and rescued via in vivo gene editing。 该研究揭示了 MSH5 基因突变是非阻塞性无精症潜在的致病原因，通过建立小鼠模型证实了 CRISPR/Cas9 基因编辑能够修复该基因突变，帮助机体产生成熟精子！图 1：来源 Signal Transduction and Targeted Therapy 2. Nature Genetics：破译荔枝的遗传密码 一骑红尘妃子笑，古代时荔枝千金难求，如今荔枝已成为人民群众餐桌上普通的水

今天，是中国传统二十四节气春分，同时也是一个少为人知的节日——世界无肉日。最初设立这一节日用以推广素食饮食，目的是拯救动物、保护环境和改善健康。当下，素食变得越来越流行。一些证据表明，素食——不吃所有肉类和鱼类，可能与总体癌症风险降低有关。有研究表明，红肉和加工肉类与增加的结直肠癌风险相关。与肉食者相比，素食者通常还摄入更多的植物性食物，如水果、蔬菜和全谷物，这也可能有助于降低某些特定部位癌症的风险。两个大型队列研究表明，素食者发生癌症（所有类型的组合）的风险较低。然而，素食与特定癌症之间的关联证据仍然有限。图片来源：站酷海洛近日，来自牛津大学纳菲尔德人口健康系的 Aurora Perez-Cornago 课题组在 BMC Medicine 上发表了题为 Risk of cancer in regular and low meat-eaters, fish-eaters, and vegetarians: a prospective analysis of UK Biobank participants 的研究性论文，在 UK Biobank 中评估了饮食组与所有癌症、结直肠癌、女性绝

免疫缺陷鼠众多，重度免疫缺陷鼠凭借无 T、B、NK 细胞更适合肿瘤造模和免疫重建等实验优势，早已在科学家的实验室中崭露头角，各大期刊也不乏它的身影，我们先来看看重度免疫缺陷 B-NDG 小鼠的过往战绩。表 1. B-NDG 小鼠近年发表文章部分列表来源：谷歌学术 看着这些高分文章，你是否心动了？使用 B-NDG 小鼠完成你精心设计的实验，获得可靠数据登上高质量文章高峰？心动不如行动，今天就先带你了解下 B-NDG 及其二代小鼠是如何完美解锁免疫重建、PDX 建模、TCR-T 药效评估等实验的？ B-NDG 在人免疫系统重建中的应用在小鼠中重建人类免疫系统（Humanized Immune System，HIS）通常通过三种方法实现： 1. 将人的外周血单个核细胞（PBMC）直接注射到重度免疫缺陷小鼠里进行免疫重建，即 PBL（Peripheral Blood Lymphocyte）-HIS 模型； 2. 单独接种人的 CD34+ 造血干细胞到经过辐照的重度免疫缺陷小鼠里进行免疫重建，即 CD34+ HSC（Hematopoietic Stem cells）-HIS 模型； 3. 移植胎

导读 肥胖是导致糖尿病、高血压、高血脂等代谢性疾病、心血管性疾病和某些肿瘤的重大危险因素，严重危害人类健康。肥胖通常是指脂肪组织中脂肪的过度积累，而脂肪根据其解剖位置和代谢功能，又可分为白色脂肪、棕色脂肪和米色脂肪（Beige fat）。 其中，米色脂肪是一类新发现的脂肪类型，拥有巨大的可塑性，其在静息时表现出白色脂肪的特质，但是当处于寒冷或肾上腺素信号激活的情况下，具有棕色化潜力，并促进产热和能量消耗，改善机体糖脂代谢。研究发现，成年人肩胛骨附近分布有米色脂肪，因此，面对当前肥胖的流行，发现有前景的基因靶点和途径，实现安全有效的米色脂肪激活，不失为一种对抗肥胖的有效手段。 热疗（Hyperthermia Therapy, HT），作为一种治疗代谢性疾病潜在的方法，成功吸引了越来越多科研人员的兴趣。前期的研究表明，通过温水浸泡的方式能改善各种动物模型的代谢状态。因此，这些数据支持了将热疗作为一种有效方式来对抗肥胖。 近日，华东师范大学生命科学学院马欣然、徐凌燕研究员携手上海交通大学附属第六人民医院胡承教授与华东师范大学生命科学学院张强研究员在国际顶尖期刊 Cell 杂志上发表了题为 L

作为 ELISA 的最后一步，检测结果的计算对整个实验十分重要。以夹心法为例。1. ELISA 的样本通常要设置 1~2 个复孔进行检测，分别求出标准品、实验组样本的吸光度的平均值。单个样本的检测值不应超出平均值的 20%。2. 样本的 OD（吸光度）平均值要减去标准品浓度为 0 时的 OD 平均值。3. 建立标准曲线在对数坐标图上拟合四参数的逻辑函数曲线（X 轴上为标准品浓度，Y 轴为对应的 OD 值）。推荐使用 origin 软件。详细步骤如下：第一步: 输入 OD 值和标准品浓度第二步：选择拟合曲线类型选中输入的数值框，按如下操作依次点击选项。第三步：勾选“find specific X/Y”完成上述操作后，点击 Fit 按键，拟合曲线和相关信息将自动生成（如第四步所示） 第四步：查看标准曲线信息（如参数值，R-Square等）第五步：设置坐标轴类型为对数。双击第四步中的拟合曲线图，对其进行编辑。双击X 轴、Y 轴设置坐标类型为“Log10”。第六步：根据标准曲线计算样本浓度选择第四个工作表（Fit NLF Find X from Y1），在左列输入样本的 OD 值，对应的

免疫检测法的精确性表现为单次实验孔间（批内）的重复性和多次实验之间（批间）的重复性。CV 值高则表明精确度低，通常由以下两个原因造成：移液技术和洗涤技术。 移液技术移液时，枪头应对准孔中央，避免接触孔壁及底部。移液后轻轻晃动混匀试剂。如果您的样品具有黏性，请预先润洗枪头以消除表面张力的影响。吸液时等待片刻使体积平衡后再取出。移液不充分或移液体积不均，说明移液器需要校正。必要时请检查移液器并重新校正。加样时，不同的试剂标准品和样本间都要确保更换枪头，避免交叉污染。确保使用合适的枪头。不合适的枪头无法正确量取吸液和加样的体积。 洗涤技术如果使用自动洗板机或多通道移液器，请确保进出口能正常运作。最后一次洗涤后，翻转酶标板倒出多余的洗涤液，并在吸水纸上拍干液体。洗板太快或太慢都会降低精确度。不能让孔内液体自然风干，需立即进行下一步操作。按照说明书，添加足量的洗涤液至孔内，并保证洗涤完全。由于洗涤液不是通用的，当试剂盒内的洗涤液用完时，请不要使用其他试剂盒中的洗涤液。如有需要，可联系技术支持寻求帮助。不要减少或增加洗涤时的浸泡时间或跳过浸泡的步骤。按照说明书上推荐的洗涤次数清洗，随意改变洗涤的次

实验开始前，各试剂和样本均应平衡至室温；样本复融后需再次离心，取上清检测；试剂或样本配制时，需充分混匀并尽量避免起泡；标曲和样本建议做复孔检测。 加样：将标准品工作液依次加入到前两列孔中，每个浓度的工作液并列加两孔，每孔50 μL。待测样品加入到其他孔，每孔50 μL(若样本浓度高于检测范围，需用标准品&样本稀释液稀释后取样)。立即每孔加入配好的生物素化抗体工作液50 μL。混匀，给酶标板覆膜，37℃孵育45分钟。提示：加样时将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，避免产生气泡。加样时间宜控制在10分钟内。洗涤：甩尽孔内液体，每孔加洗涤液350 μL，浸泡1-2分钟，吸去或甩掉酶标板内的液体，在厚的吸水纸上拍干。重复此洗板步骤3次。提示：此处与其他洗板步骤都可用洗板机。每一步洗涤充分是实验的根本。 HRP酶结合物：每孔加酶结合物工作液100 μL，混匀，加上覆膜，37℃孵育30分钟。 洗涤：弃去孔内液体，洗板5次，方法同步骤2。 底物：每孔加底物溶液(TMB)90 μL，混匀，加上覆膜，37℃避光孵育15分钟左右。提示：根据实际显色情况酌情缩短或延长孵育时间，但不可

常规用于ELISA实验的样本包含血清、血浆、细胞培养上清、尿液以及组织匀浆等。不同样本类型的预处理方法存在差异，合适的样本预处理是确保ELISA实验正确性和准确性的第一步。这里，我们将介绍几种不同样本类型的处理方法。 血清血清是ELISA实验最常用的样本，其预处理也十分简单。使用无热原无内毒素的试管或离心管采集血液样本，将试管或离心管在室温下放置1小时或4℃过夜，分离出血清（建议倾斜试管或离心管以扩大液面的横截面，使血清可以更大程度地分离出来）。2-8℃下以1000×g离心20分钟，小心收集上清液（血清），立即进行测定。建议在-20℃或-80℃下将收集的血清分装保存，避免反复冻融。在收集血液样本的过程中应避免溶血，因为红细胞在溶解时会释放具有过氧化物酶活性的物质，这种情况下，ELISA实验中将会出现非特异性显色反应，导致检测结果不准确。另外，样本还应避免细菌污染，因为细菌可能含有内源性HRP，也会导致检测结果不准确。 血浆使用含抗凝剂的采血管或离心管采集血液样本，采集后30分钟内，2-8℃下以1000×g离心15分钟，小心收集上清液（血浆）。建议在-20℃或-80℃下将收集的血浆分装保

一、ELISA的原理ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。 二、ELISA的类型ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂：（1）固相的抗原或抗体，即"免疫吸附剂"（immunosorbent）；（2）酶标记的抗原或抗体，称为"结合物"（conjugate）；（3）酶反应的底物。根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法。用于临床检验的ELISA主要有以下

1.FSC = 细胞体积大小FSC（Forward Scatter，前向散射光），细胞散射光涉及光的折射、反射和衍射，是一个光学测量值。对FSC 影响最大的是细胞内部和外部折射率之间的差异，所以 FSC 可以辅助判断细胞的大小。但是细胞核质比、细胞颗粒的数量和类型以及细胞表面形状等因素也会影响细胞散射光。因此，不要总是认为较大的 FSC 一定等于较大的细胞体积。2.细胞固定用的是 1％ 多聚甲醛（PFA）多聚甲醛（PFA）是不溶于水的白色粉末，而在使用前我们需要将其配置成溶液：通过加热或者碱化等方法将 1% 的多聚甲醛溶于 PBS 或者蒸馏水中，但是，多聚甲醛一旦溶解形成溶液，它实际上就是甲醛溶液。3.细胞是用 FACS 检测的错误 1：FACS 是 Fluorescence Activated Cell Sorter的首字母缩写词，是荧光激活细胞分选仪，而检测细胞用到的是分析仪，而非分选仪。流式细胞仪应该是 Flow Cytometry，简写为 FCM。错误 2：FACS 是 Becton Dickinson 的商品名，因此所有 FACS 都是流式细胞仪，但并非所有的流式细胞仪都叫