NA序列分析技术是现代生命科学研究的核心技术之一，而双脱氧核苷酸链终止法(Sanger法)是目前使用最普遍的DNA序列分析技术。在基于Sanger法的全自动DNA测序技术中，测序反应产生的DNA片段是荧光标记的，这些片段经过平板胶电泳或毛细管电泳得到分离，荧光分子被激发而发光，发出的光信号被检测系统检测。Sanger法的优势在于可以分析未知DNA的序列，且单向反应的读序能力较长，目前的技术可以达到1000b ...
核酸环介导等温扩增技术原理及引物设计与实例烟头整理1．LAMP引物的设计：LAMP引物的设计主要是针对靶基因的六个不同的区域，基于靶基因3’ 端的F3c、F2c和Flc区以及5’ 端的Bl、B2和B3区等6个不同的位点设计4种引物。FIP(Forward Inner Primer)：上游内部引物，由F2区和F1C区域组成，F2区与靶基因3’端的F2c区域互补，F1C区与靶基因5’端的Flc区域序列相同。F3引物：上游外部引物(Fo ...
欢迎来到《PCR技术讨论版》：本版归属于“实验技术讨论区”，以讨论各种PCR技术和PCR相关技术为主。本版的宗旨是为您提供各种PCR的相关理论和实践经验的交流平台！欢迎您参与交流！发贴必读&加分标准： 新手朋友（0~5分），加分从优 --- 跟丁香园大政策保持一致1、欢迎介绍自己原创资源（包括原创文章、课件、ebook、技术经验、心得体会等），斑竹视情况加1～5分。2、求助或发布资源前请先用 功能在本版检索一下，或到 旧帖资源索引区检索一下（推荐 ...
从用PRIMER premier设计引物到查看您所设计的引物会不会有目的产物，以人的APP基因为例1、打开pubmed http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/ ，在search的下拉菜单中选择 Gene或者直接打开这个链接http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene2、输入 APP （或者其他的 待测基因名称或者缩写均可，以下均以APP为例）；点GO，出来的结果是各个物种的APP基因，人的排在第一个 ...
第一章 PCR和RT-PCR基础PCR基础聚合酶链式反应（PCR）过程利用模板变性，引物退火和引物延长的多个循环来扩增DNA序列。这是一个指数增长的过程，因为上一轮的扩增产物又作为下一轮扩增的模板，使其成为检测核酸的一种非常灵敏的技术。一般，经过20-30个循环得到的扩增产物就足够在溴化乙锭染色的凝胶上观察到。反应包括几个成分（表1）。模板可以为纯化的基因组或质粒DNA；由RNA转化得到的cDNA；或未经纯化的粗制生 ...
用的是clontech的kit.3.2.2.1cDNA第一链的合成1)在0.5ml经DEPC处理过的离心管中分别加入tester和driver的mtRNA各2ug，然后加入1ul(10uM) 随机引物(9mer)，70℃温浴2min,然后迅速置于冰上放置2min，然后在每管中加入如下混合物：5×First-strand Buffer 2uldNTPs Mix(10mM) 1ulsterile H2O 1ulAMV Reverse Transcripta ...
面对如此功能强大的两个引物设计软件，不知如何使用确实难事！Oligo使用方法介绍作为目前最好、最专业的引物设计软件，Oligo的功能很强，在这里我们介绍它的一些主要功能：如：普通引物对的搜索、测序引物的设计、杂交探针的设计以及评估引物对质量等等。在正式进行引物设计前，我们首先面临的一个任务就是向Oligo程序导入模板序列，根据不同的实验情况，导入模板有三种方法：1， 直接用键盘输入：a， 点击file菜单中的New Sequ ...
PCR咖啡吧咖啡者，香甘醇酸苦五味俱全，原始而又粗犷，深邃而又耐人寻味。早期“科学咖啡馆”的雏型为J.J.汤姆森在19世纪末建立的卡文迪许物理学会，科学家每天午后茶时漫谈，他们谈他们看到、听到、测试、观察到的现象和发生的事件。卢瑟福在领导这个实验室时把午后茶漫谈变成他领导的科学家们每天最重要时刻。后来传于世的剑桥风格——“在悠闲中治学”、“自由和独立的工作”便源于此。卡文迪许实验室为国际顶尖实验室，在物理、分子生物学方面 ...
精华帖是一个版块的主要财富，也是广大战友查阅知识的主要途径，其价值正如其名，是精华中的精华。但是由于本版发帖较多，而且有相当一部分战友还不知道如何去搜索精华帖的内容。另外，大部分精华帖现在已经不再置顶，导致精华帖沉底，以致在前几页无法找到精华帖。鉴于此，特发此整理帖。帖子以超链接的形式列出本版建版以来的所有精华帖，以方便广大战友查阅。请广大战友有何疑问先查阅精华帖，相信你会得到一定的帮助。请勿跟帖,谢谢。丁香园引物 ...
(一）PCR产物的电泳检测时间 一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。假阴性，不出现扩增条带 PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及， ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模 板核酸变性不彻底。在酶和引物质 ...
qPCR方法的准确性和可重复性一直备受争议。即使同一批样品、同一个人操作，在不同的时间点，可能会获得趋势一致，但是结果不同的的qPCR data。对于定量RT-PCR来说，获得一个误差小、重复性高的定量PCR结果，关键在于以下因素：1,从组织和细胞获得原始材料时，细心程度和可重复程度；2，RNA的抽提和纯化3，RNA的反转录4，将cDNA进行定量PCR扩增5，操作者“双手”的灵巧程度事实上，即使是那些非常有经验的PCR技 ...
一个PCR相关的专业网站，内容很全http://www.pcrlinks.com/实验方法与步骤详解http://swjsx.ntmc.edu.cn/Protocol/home.htm美国AXYgen公司http://www.axygen.com/NewFiles/pcr.htmlhttp://www.alkami.com/This 158 page PCR manual covers the following topicsPCR Primer designPCR M ...
RNA很脆弱,小心操作哦:实验中的一些好习惯加入试剂之前,把它混匀一下,以免放置时间长了浓度不均移液枪用完之后要归到最大计量的位置，防止久而久之弹簧失去弹性一定要记着关水浴箱，切记切记多和大家讨论，同时多关注别人讨论的经验，这几乎是最快提高的捷径了所有的试剂都自己配，出了问题才好找原因防止RNA酶污染的措施1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用 ...
一家之说，欢迎指教！1．简介寡聚核苷酸引物的选择，通常是整个扩增反应成功的关键。所选的引物序列将决定PCR产物的大小、位置、以及扩增区域的Tm值这个和扩增物产量有关的重要物理参数。好的引物设计可以避免背景和非特异产物的产生，甚至在RNA-PCR中也能识别cDNA或基因组模板。引物设计也极大的影响扩增产量：若使用设计粗糙的引物，产物将很少甚至没有；而使用正确设计的引物得到的产物量可接近于反应指数期的产量理论值。当然 ...
看到很多关于RT-PCR的求助贴，而且都是围绕那么几个问题。结合自己做RT-PCR的一些经验，先做个总结，不足之处请各位大虾补充。希望能够抛砖引玉，呵呵。1.RT-PCR时，内参能出来而目的条带不出来的可能原因：(1)RNA部分降解了。很多人都把内参作为判断cDNA模板质量的一个非常重要的标准，认为内参能出来那么cDNA一链质量肯定没问题。但我一直都认为，内参能P出来，仅仅只能说明RT成功了，但与cDNA一链的质量并 ...
没有做过Realtime PCR,先查些资料，顺便贴这儿跟新手们分享一下。定量PCR常见问题及对策Q1．无CT值（信号）出现A1．1.反应循环数不够。一般都要在35个循环以上，可根据实验情况增加循环（如至45cycles），但高于45个循环会增加过多的背景信号。2.检测荧光信号的步骤有误。一般SG法采用72℃延伸时采集，Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。3.引物或探针降解。可通过PAGE电泳检测其完整性。 ...
PCR相关经验分享PCR常见问题-分析及对策(无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性)问题1：无扩增产物现象：正对照有条带，而样品则无原因:1.模板:含有抑制物，含量低2.Buffer对样品不合适3.引物设计不当或者发生降解4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短对策:1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量2.更换Buffer或调整浓度3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物4. ...
小弟接触简并引物PCR已经有一段时间了，虽然说不上是老手，但是至少不是新手了，对于简并引物PCR有了初步的了解。在dxy里，看了很多这方面的帖子，逐步认识了这个试验。但是我在试验过程中发现，还是有很多的问题我解决不了，我曾经发过关于简并引物PCR的帖子，但是回答的人几乎没有，我不知道是这个试验本生就很难，还是什么别的，我反正觉得特难！我的模板是细菌基因DNA，我用生工的UNIQ－10柱式kit，得到的基因组DNA ...
PCR引物设计的黄金法则1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。2.引物长度一般在15~30碱基之间。引物长度（primer length）常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶 ...
xjktony扩增模板的GC 含量为66％,也不算很高,我做过更高的GC 含量(80%)的PCR.对于 这种高GC含量的PCR,要加些DMSO等,以解除其二级结构的影响,当然现在也有专门这种PCR Buffer卖.vanny宝生物有这种做高GC含量的酶和buffer，称为LA TAKARA酶，里面有GC buffer，效果还不错。westernblot你用DMSO5％加到里面，60％应该不是算高的，如果实在不行，就用advantage 2 high GC ...
