【原创】刚写完论文,把我整理的SSH的步骤(中文版)拿来共享
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用的是clontech的kit.
3.2.2.1 cDNA第一链的合成
1) 在0.5ml经DEPC处理过的离心管中分别加入tester和driver的mtRNA各2ug，然后加入1ul(10uM) 随机引物(9mer)，70℃温浴2min,然后迅速置于冰上放置2min，然后在每管中加入如下混合物：
5×First-strand Buffer 2ul
dNTPs Mix(10mM) 1ul
sterile H2O 1ul
AMV Reverse Transcriptase(20U/ul) 1ul
2) 42℃反应1.5hr.，然后将离心管置于冰上,终止cDNA第一链的合成,然后马上进行第二链的合成。
3.2.2.2 cDNA第二链的合成
1) 在已经合成好cDNA第一链的离心管中加入每管如下反应物，16℃反应2hr：
sterile H2O 48.4ul
5×Second-strand Buffer 16.0ul
dNTPs Mix(10mM) 1.6ul
20×Second-strand Enzyme Cocktail 4.0ul
2) 加入2ul(6U)T4 DNA Polymerase，16℃反应30min。
3) 加入20×EDTA/Glycogen Mix 4ul，以终止反应。
4) 加入100ul 苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提,并沉淀出cDNA双链,溶解于50ul双蒸水中。
3.2.2.3 cDNA质量检测
3.2.2.4 Rsa I酶切双链cDNA
1) tester和driver cDNA经37℃过夜酶切，酶切体系为：
ds cDNA 43.5ul
10×Rsa Restriction Buffer 5.0ul
Rsa I(10U/ul) 1.5ul
2) 每管用2.5ul EDTA/Glycogen混合物终止反应。
3) 加入50ul 苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提，并沉淀出酶切后的cDNA双链，溶解于5.5ul双蒸水中。
3.2.2.5 接头连接
酶切消化的tester双链cDNA分为两份，一份与Adaptor1连接，另一份与Adaptor2连接，具体步骤如下：
1) 取1ul酶切的tester ds cDNA用5ul ddH2O稀释；
2) 连接反应液(Ligation Master Mix)的制备如下：
sterile H2O 3ul
5×Ligation Buffer 2ul
T4 DNA Ligase 1ul
3) 在两个EP管中分别加入如下试剂：
component Tester1-1 Tester1-2
diluted tester cDNA 2ul 2ul
Adaptor1(10Um) 2ul /
Adaptor2(10uM) / 2ul
Ligation master mix 6ul 6ul
Final volume 10ul 10ul
4) 在另一离心管中混合1.5ul tester1-1和1.5ul tester1-2，连接反应完成后即为本实验所需要的unsubtracted tester control 1-c；
5) 轻微离心，16℃过夜连接；
6) 加入1ul 20×EDTA/Glycogen Mix,终止反应；72℃温育5min使ligase失活；
7) 取1ul unsubtracted tester control 1-c，用1ml ddH2O稀释，该样品将用来进行PCR检测；
8) 所有样品放入-20℃保存。
3.2.2.6 第一次杂交
1) 每个杂交反应的体系为：
component Hybridzation sample 1 Hybridzation sample 2
Rsa digested driver cDNA 1.5ul 1.5ul
Tester1-1(ligated adaptor1) 1.5ul /
Tester1-2(ligated adaptor2) / 1.5ul
4×Hybridzaion Buffer 1ul 1ul
Final volume 4ul 4ul
2) 每个反应管中加一滴矿物油覆盖，短暂离心；
3) 98℃ 5min，使DNA充分变性；
4) 68℃ 杂交10小时(杂交时间不少于6小时，也不能超过12小时)，完成后立即进行第二次杂交。
3.2.2.7 第二次杂交
1) 配制第二次杂交混合液
Driver cDNA 1ul
4×Hybridzaion Buffer 1ul
sterile water 2ul
2)取1ul混合液加一滴矿物油覆盖后于PCR仪上98℃变性1.5min；
3)将移液器调到15ul，轻轻将枪头伸入Hybridzation sample 2中矿物油与液面交界出，小心将样品吸出，并吸入少许空气;用同样的方法吸入新鲜的变性driver，此时hybridzation sample 2和新鲜变性driver在枪头内由一段气体柱分开，将这一状态的混合物打入装有hybridzation sample 1的离心管中，用枪头混匀，短暂离心。
4)68℃过夜。
5)加入200ul的dilution buffer后68℃ 保温7min。
至此杂交完成,差减杂交完毕后将进行两轮PCR扩增。
3.2.2.8 两次PCR扩增
第一次扩增反应体系为:
10×Taq polymerase Buffer 2ul
dNTPs(10uM) 0.4ul
Primer 1(10uM) 1ul
Taq polymerase(2U/ul) 0.5ul
ddH2O 14.1ul
第二次杂交产物 2ul
终体积20ul
第一次扩增程序为:
step1 75℃ 5min;
step2 94℃ 30sec;
step3 66℃ 30sec;
step4 72℃ 1.5min;
step5 go to step2 34 cycles;
step6 72℃ 5min;
step7 4℃ hold
产物10倍稀释作为第二次PCR的模板。
第二次扩增反应体系为:
10×Taq polymerase Buffer 2ul
dNTPs(10uM) 0.4ul
nested primer 1(10uM) 1ul
nested primer 2(10uM) 1ul
Taq polymerase(2U/ul) 0.5ul
ddH2O 13.1ul
10倍稀释后的第一次PCR产物 2ul
终体积20ul。
第二次扩增反应程序为：
step1 94℃ 30sec;
step2 68℃ 30sec;
step3 72℃ 1.5min;
step4 go to step1 17 cycles;
step5 72℃ 5min;
step6 4℃ hold
反应结束后用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。
3.2.2.1 cDNA第一链的合成
1) 在0.5ml经DEPC处理过的离心管中分别加入tester和driver的mtRNA各2ug，然后加入1ul(10uM) 随机引物(9mer)，70℃温浴2min,然后迅速置于冰上放置2min，然后在每管中加入如下混合物：
5×First-strand Buffer 2ul
dNTPs Mix(10mM) 1ul
sterile H2O 1ul
AMV Reverse Transcriptase(20U/ul) 1ul
2) 42℃反应1.5hr.，然后将离心管置于冰上,终止cDNA第一链的合成,然后马上进行第二链的合成。
3.2.2.2 cDNA第二链的合成
1) 在已经合成好cDNA第一链的离心管中加入每管如下反应物，16℃反应2hr：
sterile H2O 48.4ul
5×Second-strand Buffer 16.0ul
dNTPs Mix(10mM) 1.6ul
20×Second-strand Enzyme Cocktail 4.0ul
2) 加入2ul(6U)T4 DNA Polymerase，16℃反应30min。
3) 加入20×EDTA/Glycogen Mix 4ul，以终止反应。
4) 加入100ul 苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提,并沉淀出cDNA双链,溶解于50ul双蒸水中。
3.2.2.3 cDNA质量检测
3.2.2.4 Rsa I酶切双链cDNA
1) tester和driver cDNA经37℃过夜酶切，酶切体系为：
ds cDNA 43.5ul
10×Rsa Restriction Buffer 5.0ul
Rsa I(10U/ul) 1.5ul
2) 每管用2.5ul EDTA/Glycogen混合物终止反应。
3) 加入50ul 苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提，并沉淀出酶切后的cDNA双链，溶解于5.5ul双蒸水中。
3.2.2.5 接头连接
酶切消化的tester双链cDNA分为两份，一份与Adaptor1连接，另一份与Adaptor2连接，具体步骤如下：
1) 取1ul酶切的tester ds cDNA用5ul ddH2O稀释；
2) 连接反应液(Ligation Master Mix)的制备如下：
sterile H2O 3ul
5×Ligation Buffer 2ul
T4 DNA Ligase 1ul
3) 在两个EP管中分别加入如下试剂：
component Tester1-1 Tester1-2
diluted tester cDNA 2ul 2ul
Adaptor1(10Um) 2ul /
Adaptor2(10uM) / 2ul
Ligation master mix 6ul 6ul
Final volume 10ul 10ul
4) 在另一离心管中混合1.5ul tester1-1和1.5ul tester1-2，连接反应完成后即为本实验所需要的unsubtracted tester control 1-c；
5) 轻微离心，16℃过夜连接；
6) 加入1ul 20×EDTA/Glycogen Mix,终止反应；72℃温育5min使ligase失活；
7) 取1ul unsubtracted tester control 1-c，用1ml ddH2O稀释，该样品将用来进行PCR检测；
8) 所有样品放入-20℃保存。
3.2.2.6 第一次杂交
1) 每个杂交反应的体系为：
component Hybridzation sample 1 Hybridzation sample 2
Rsa digested driver cDNA 1.5ul 1.5ul
Tester1-1(ligated adaptor1) 1.5ul /
Tester1-2(ligated adaptor2) / 1.5ul
4×Hybridzaion Buffer 1ul 1ul
Final volume 4ul 4ul
2) 每个反应管中加一滴矿物油覆盖，短暂离心；
3) 98℃ 5min，使DNA充分变性；
4) 68℃ 杂交10小时(杂交时间不少于6小时，也不能超过12小时)，完成后立即进行第二次杂交。
3.2.2.7 第二次杂交
1) 配制第二次杂交混合液
Driver cDNA 1ul
4×Hybridzaion Buffer 1ul
sterile water 2ul
2)取1ul混合液加一滴矿物油覆盖后于PCR仪上98℃变性1.5min；
3)将移液器调到15ul，轻轻将枪头伸入Hybridzation sample 2中矿物油与液面交界出，小心将样品吸出，并吸入少许空气;用同样的方法吸入新鲜的变性driver，此时hybridzation sample 2和新鲜变性driver在枪头内由一段气体柱分开，将这一状态的混合物打入装有hybridzation sample 1的离心管中，用枪头混匀，短暂离心。
4)68℃过夜。
5)加入200ul的dilution buffer后68℃ 保温7min。
至此杂交完成,差减杂交完毕后将进行两轮PCR扩增。
3.2.2.8 两次PCR扩增
第一次扩增反应体系为:
10×Taq polymerase Buffer 2ul
dNTPs(10uM) 0.4ul
Primer 1(10uM) 1ul
Taq polymerase(2U/ul) 0.5ul
ddH2O 14.1ul
第二次杂交产物 2ul
终体积20ul
第一次扩增程序为:
step1 75℃ 5min;
step2 94℃ 30sec;
step3 66℃ 30sec;
step4 72℃ 1.5min;
step5 go to step2 34 cycles;
step6 72℃ 5min;
step7 4℃ hold
产物10倍稀释作为第二次PCR的模板。
第二次扩增反应体系为:
10×Taq polymerase Buffer 2ul
dNTPs(10uM) 0.4ul
nested primer 1(10uM) 1ul
nested primer 2(10uM) 1ul
Taq polymerase(2U/ul) 0.5ul
ddH2O 13.1ul
10倍稀释后的第一次PCR产物 2ul
终体积20ul。
第二次扩增反应程序为：
step1 94℃ 30sec;
step2 68℃ 30sec;
step3 72℃ 1.5min;
step4 go to step1 17 cycles;
step5 72℃ 5min;
step6 4℃ hold
反应结束后用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。
