【建议】oligo 和premier 两款引物设计软件使用指导
丁香园论坛
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面对如此功能强大的两个引物设计软件，不知如何使用确实难事！
Oligo使用方法介绍
作为目前最好、最专业的引物设计软件，Oligo的功能很强，在这里我们介绍它的一些主要功能：如：普通引物对的搜索、测序引物的设计、杂交探针的设计以及评估引物对质量等等。
在正式进行引物设计前，我们首先面临的一个任务就是向Oligo程序导入模板序列，根据不同的实验情况，导入模板有三种方法：
1， 直接用键盘输入：
a， 点击file菜单中的New Sequence 浮动命令，或直接点击工具栏中的New Sequence命令，进入序列展示窗口；
b， 此时即可键入DNA序列；
c， 如果需要的话，Oligo提供碱基回放功能，在边键入时边读出碱基，防止输入错误。点击Edit菜单中的“Readback on”即可。
2， 利用复制和粘贴：当我们序列已经作为TXT文件存在或其它oligo不能直接open的文件格式，如word文件.html格式，这个功能就显得很有用了。在相应文件中复制序列后在序列展示窗口粘贴，oligo会自动去除非碱基字符。当序列输入或粘贴完成后，点击Accept/Discard菜单中的Accept浮动命令，即可进入引物设计模式。
3， 如果序列已经保存为Seq格式或者FASTA，GenBank格式时，oligo就可以直接打开序列文件。
点击File菜单中的“Open”浮动命令，找到所需文件，打开即可。
进入引物设计模式后，oligo一般会弹出三个窗口，分别是6－碱基频率窗口，碱基退火温度窗口以及序列内部碱基稳定性窗口，其中的退火温度窗口是我们引物设计的主窗口，其它的两个窗口则在设计过程中起辅助作用，比如6－碱基频率窗口可以使我们很直观地看到所设计引物在相应物种基因组中的出现频率，如果我们的模板是基因组DNA或混合DNA时，该信息就显得有用了，而内部稳定性窗口则可以显示引物的5’端稳定性是否稍高于3’端等。
一，普通引物对的搜索：
以Mouse 4E（cDNA序列）为例。我们的目的是以Mouse 4E（2361 bp）为模板，设计一对引物来扩增出600－800bp长的PCR产物。
1，点击“Search“菜单中的”For Primers and Probes“命令，进入引物搜索对话框；
2，由于我们要设计的是一对PCR引物，因此正、负链的复选框都要选上，同时选上Compatible pairs。
在Oligo默认的状态下，对此引物对的要求有：a，无二聚体；b，3’端高度特异，GC含量有限定，d，去除错误引发引物等。
3，剩下的工作是确定上、下游引物的位置及PCR产物的长度以及引物设计参数。
①单击：“search Ranges”按钮，弹出“Search Ranges”对话框。输入上游引物的范围：1－2000，下游引物的位置：100－2300；PCR产物的长度600－800bp。
②单击“Paramaters”按钮进入“Search Parameters”对话框，对话框种分三个活页，分别是：不同设定，参数以及更多参数。
③在“普通设定”窗口，为我们提供了对引物非常直观的设定方法，从高到低分六个等级，最后还有一个用户定制选项。
④当我们对引物的各种参数的含义及应该设定多大值并不是特别清楚时，就可以直接设定Very high/High等来完成对引物设计参数的设定。
⑤当我们选中“Automatically Change String”后，Oligo会在引物搜索过程中：如果在高等级设定中无法找到引物对时自动降低一个定级来进行搜索，知道找到引物对。在设计反向PCR引物对时，就选中“Inverse PCR”复选框。
⑥我们还可以让引物的长度可以改变，以适应设定的Tm值或PE？（Prime Effitions，引发效率）。也可以限定所选引物对的最大数目。
⑦在“Parameters”窗口中，实际上需要我们改动的只有引物的长度，根据试验的要求作相应的改变，如23nt。其他参数就使用Oligo的默认值，一般无需改变。在“More Parameters“窗口中，一般也无需作任何改变，直接用Oligo的默认值。
4，点击“确认”－“Ok”进入搜索窗口，再次单击“OK”后，Oligo自动完成引物对的搜索，并出现一个搜索结果窗口。显示出得到的引物对数目。
5，点击“Ok”，出现“PrimerPairs”窗口，在窗口中列出了7对引物的简单信息，引物位置，产物长度，最佳退火温度及GC含量。单击“Sort”按钮，可以按产物长度，最佳退火温度及GC含量从小到大或从大到小的顺序排列。
6，点击任意一对引物，在旁边马上弹出一个叫“PCR”的窗口，在窗口中我们可以看到这对引物在模板中的大概位置，最佳退火温度（该温度可以直接应用于我们实际PCR中的第二步退火）。另外还有引物的Tm值，GC含量，引发效率，同时还计算出了产物的Tm值于引物Tm值的差异以及引物间Tm值的差异。一般我们尽量保持前者在20度以内，后者在5－6度以内。点击不同的引物对时，PCR窗口内容同时作相应的改变。
7，要想了解引物的详细信息，如二聚体，发卡结构形成情况、组成、Tm值和错误引发位点等，这时只需点击“Analyze”菜单中的相应命令，就可以分别得到相关信息。例如点击“Duplex Formation”，我们就可以得到上游引物间，下游引物间及上下游引物间形成二聚体的情况。同理，“Hairpin Formation”，“Composition and Tm”，“False Priming Sites”等命令就可以显示出相关信息。所有这些分析的结果都有助于我们从Oligo搜索得到的多对引物中选择最佳的引物对。
需要说明的是，1，如果一次搜索得到的引物对太多时，我们可以适当提高选定的条件和规定更合适的搜索范围来减少引物对数；2，引物一般尽量不要在3’端或是离3’端太近的位置形成二聚体，同时二聚体的自有能绝对值尽量小于10；3，对于错误引发，在普通PCR中，如果引发效率在160 points以上时，就可能出现杂带，在测序反应中，错误引发效率则应该严格控制在120 points以下。
8，Oligo中每对引物的详细信息可以直接导出为一个文本文件：
首先点击“File”菜单中的“Print/Save Options”，在出现的对话框中的普通设定选中“Selected”；在“Analyze I”中选择需要保存的信息，在“Analyze II”中选中PCR。
单击确定按钮退出，这时再次点击“File”菜单，Save浮动命令中的“Data Save as”，选择路径及文件名即可。
二，测序引物的设计：
在oligo中，测序引物设计过程与普通引物设计大部分都很相似。
还是以Mouse 4E为例，假如我们要在600－800bp的位置设计一条测序引物。
Open－Search
在“Search”窗口中，选中“Sequece Primer”，同时去除负链Search的选中
在“Search Range”窗口，输入正链的600－800bp
在“Parameters”中选定 very high ，引物长度改为18bp
结果得到11条测序引物，与普通引物同理，根据其详细信息就可以挑选到一条最佳的测序引物。
三，探针的设计：
探针的设计与测序引物设计基本相同，只需使“Search”窗口的探针设计选中，改变探针的长度就可以。
四，评估引物对：
我们在各种文献中查到的引物，如果直接进行PCR，往往很难重复别人的实验结果。这时就想到，是不是引物的质量有问题？能不能用软件来对这些问题引物进行一些分析呢？答案时肯定的。
1，点击File菜单中的New命令；
2，在“Edit New Sequence”的窗口中用键盘输入上游引物；
3，如果该引物的首位置不是1的话，可以在“Edit”窗口中输入新的5’端位置数字，如20；
4，点击Accept/Discard菜单的Accept命令；
5，如果引物序列长度不同于当前的引物的话，可以从“Change”菜单中改变当前的引物长度；
6，选取当前序列为上游引物（点击“upper”按钮）；
7，从Edit菜单中选取“Lower Primer”命令，在Edit Lower窗口中输入下游引物的序列；
8，在Edit窗口的上角处，输入相应的5’位置；
9，选取“Accept and Quit”命令；
如果想让程序给出最佳退火温度，在此时的对话框中输入PCR产物的长度以及GC含量所占百分比，一般哺乳动物的cDNA序列中GC大约占44％。
10，点击OK就可以在“Analyze”菜单中完成各种分析了。
Oligo使用方法介绍
作为目前最好、最专业的引物设计软件，Oligo的功能很强，在这里我们介绍它的一些主要功能：如：普通引物对的搜索、测序引物的设计、杂交探针的设计以及评估引物对质量等等。
在正式进行引物设计前，我们首先面临的一个任务就是向Oligo程序导入模板序列，根据不同的实验情况，导入模板有三种方法：
1， 直接用键盘输入：
a， 点击file菜单中的New Sequence 浮动命令，或直接点击工具栏中的New Sequence命令，进入序列展示窗口；
b， 此时即可键入DNA序列；
c， 如果需要的话，Oligo提供碱基回放功能，在边键入时边读出碱基，防止输入错误。点击Edit菜单中的“Readback on”即可。
2， 利用复制和粘贴：当我们序列已经作为TXT文件存在或其它oligo不能直接open的文件格式，如word文件.html格式，这个功能就显得很有用了。在相应文件中复制序列后在序列展示窗口粘贴，oligo会自动去除非碱基字符。当序列输入或粘贴完成后，点击Accept/Discard菜单中的Accept浮动命令，即可进入引物设计模式。
3， 如果序列已经保存为Seq格式或者FASTA，GenBank格式时，oligo就可以直接打开序列文件。
点击File菜单中的“Open”浮动命令，找到所需文件，打开即可。
进入引物设计模式后，oligo一般会弹出三个窗口，分别是6－碱基频率窗口，碱基退火温度窗口以及序列内部碱基稳定性窗口，其中的退火温度窗口是我们引物设计的主窗口，其它的两个窗口则在设计过程中起辅助作用，比如6－碱基频率窗口可以使我们很直观地看到所设计引物在相应物种基因组中的出现频率，如果我们的模板是基因组DNA或混合DNA时，该信息就显得有用了，而内部稳定性窗口则可以显示引物的5’端稳定性是否稍高于3’端等。
一，普通引物对的搜索：
以Mouse 4E（cDNA序列）为例。我们的目的是以Mouse 4E（2361 bp）为模板，设计一对引物来扩增出600－800bp长的PCR产物。
1，点击“Search“菜单中的”For Primers and Probes“命令，进入引物搜索对话框；
2，由于我们要设计的是一对PCR引物，因此正、负链的复选框都要选上，同时选上Compatible pairs。
在Oligo默认的状态下，对此引物对的要求有：a，无二聚体；b，3’端高度特异，GC含量有限定，d，去除错误引发引物等。
3，剩下的工作是确定上、下游引物的位置及PCR产物的长度以及引物设计参数。
①单击：“search Ranges”按钮，弹出“Search Ranges”对话框。输入上游引物的范围：1－2000，下游引物的位置：100－2300；PCR产物的长度600－800bp。
②单击“Paramaters”按钮进入“Search Parameters”对话框，对话框种分三个活页，分别是：不同设定，参数以及更多参数。
③在“普通设定”窗口，为我们提供了对引物非常直观的设定方法，从高到低分六个等级，最后还有一个用户定制选项。
④当我们对引物的各种参数的含义及应该设定多大值并不是特别清楚时，就可以直接设定Very high/High等来完成对引物设计参数的设定。
⑤当我们选中“Automatically Change String”后，Oligo会在引物搜索过程中：如果在高等级设定中无法找到引物对时自动降低一个定级来进行搜索，知道找到引物对。在设计反向PCR引物对时，就选中“Inverse PCR”复选框。
⑥我们还可以让引物的长度可以改变，以适应设定的Tm值或PE？（Prime Effitions，引发效率）。也可以限定所选引物对的最大数目。
⑦在“Parameters”窗口中，实际上需要我们改动的只有引物的长度，根据试验的要求作相应的改变，如23nt。其他参数就使用Oligo的默认值，一般无需改变。在“More Parameters“窗口中，一般也无需作任何改变，直接用Oligo的默认值。
4，点击“确认”－“Ok”进入搜索窗口，再次单击“OK”后，Oligo自动完成引物对的搜索，并出现一个搜索结果窗口。显示出得到的引物对数目。
5，点击“Ok”，出现“PrimerPairs”窗口，在窗口中列出了7对引物的简单信息，引物位置，产物长度，最佳退火温度及GC含量。单击“Sort”按钮，可以按产物长度，最佳退火温度及GC含量从小到大或从大到小的顺序排列。
6，点击任意一对引物，在旁边马上弹出一个叫“PCR”的窗口，在窗口中我们可以看到这对引物在模板中的大概位置，最佳退火温度（该温度可以直接应用于我们实际PCR中的第二步退火）。另外还有引物的Tm值，GC含量，引发效率，同时还计算出了产物的Tm值于引物Tm值的差异以及引物间Tm值的差异。一般我们尽量保持前者在20度以内，后者在5－6度以内。点击不同的引物对时，PCR窗口内容同时作相应的改变。
7，要想了解引物的详细信息，如二聚体，发卡结构形成情况、组成、Tm值和错误引发位点等，这时只需点击“Analyze”菜单中的相应命令，就可以分别得到相关信息。例如点击“Duplex Formation”，我们就可以得到上游引物间，下游引物间及上下游引物间形成二聚体的情况。同理，“Hairpin Formation”，“Composition and Tm”，“False Priming Sites”等命令就可以显示出相关信息。所有这些分析的结果都有助于我们从Oligo搜索得到的多对引物中选择最佳的引物对。
需要说明的是，1，如果一次搜索得到的引物对太多时，我们可以适当提高选定的条件和规定更合适的搜索范围来减少引物对数；2，引物一般尽量不要在3’端或是离3’端太近的位置形成二聚体，同时二聚体的自有能绝对值尽量小于10；3，对于错误引发，在普通PCR中，如果引发效率在160 points以上时，就可能出现杂带，在测序反应中，错误引发效率则应该严格控制在120 points以下。
8，Oligo中每对引物的详细信息可以直接导出为一个文本文件：
首先点击“File”菜单中的“Print/Save Options”，在出现的对话框中的普通设定选中“Selected”；在“Analyze I”中选择需要保存的信息，在“Analyze II”中选中PCR。
单击确定按钮退出，这时再次点击“File”菜单，Save浮动命令中的“Data Save as”，选择路径及文件名即可。
二，测序引物的设计：
在oligo中，测序引物设计过程与普通引物设计大部分都很相似。
还是以Mouse 4E为例，假如我们要在600－800bp的位置设计一条测序引物。
Open－Search
在“Search”窗口中，选中“Sequece Primer”，同时去除负链Search的选中
在“Search Range”窗口，输入正链的600－800bp
在“Parameters”中选定 very high ，引物长度改为18bp
结果得到11条测序引物，与普通引物同理，根据其详细信息就可以挑选到一条最佳的测序引物。
三，探针的设计：
探针的设计与测序引物设计基本相同，只需使“Search”窗口的探针设计选中，改变探针的长度就可以。
四，评估引物对：
我们在各种文献中查到的引物，如果直接进行PCR，往往很难重复别人的实验结果。这时就想到，是不是引物的质量有问题？能不能用软件来对这些问题引物进行一些分析呢？答案时肯定的。
1，点击File菜单中的New命令；
2，在“Edit New Sequence”的窗口中用键盘输入上游引物；
3，如果该引物的首位置不是1的话，可以在“Edit”窗口中输入新的5’端位置数字，如20；
4，点击Accept/Discard菜单的Accept命令；
5，如果引物序列长度不同于当前的引物的话，可以从“Change”菜单中改变当前的引物长度；
6，选取当前序列为上游引物（点击“upper”按钮）；
7，从Edit菜单中选取“Lower Primer”命令，在Edit Lower窗口中输入下游引物的序列；
8，在Edit窗口的上角处，输入相应的5’位置；
9，选取“Accept and Quit”命令；
如果想让程序给出最佳退火温度，在此时的对话框中输入PCR产物的长度以及GC含量所占百分比，一般哺乳动物的cDNA序列中GC大约占44％。
10，点击OK就可以在“Analyze”菜单中完成各种分析了。
