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【求助】从人的外周血同时提取血清、RNA和蛋白

向左还是向右 我是第一次做实验,想从人的外周血中(加过抗凝剂的)取血清,然后用淋巴分离液提取单个核细胞,从单个核细胞中同时提取RNA和蛋白,不知有没有前辈做过类似实验,请赐教,十分感谢向左还是向右 我用的TRIZOL同时提取的RNA和蛋白,可是蛋白怎么也溶解不了,不知有没有好办法?大胜仔 首先呢,加过抗凝剂取的是血浆,不是血清,我也查了查“Ficoll密度梯度离心法”对于单个核细胞的提取这个方法好像好点儿本文由丁香园论坛提供 ...

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【求助】转染对细胞形态的影响

蓝莓之夏 各位大侠:我做的是关于microRNA mimics 转染的实验,正在做预实验。之前从基因芯片中挑选出了microRNA, 然后合成了他的类似物,也就是mimics.。 我在转染进去24h之后,还要加入TGF-β进行刺激,观察转染的作用。现在我的问题是: 我选的microRNA mimics 是对细胞有保护抗纤维化作用的,TGF-β 是诱导纤维化作用的。转染进去又加入TGF之后,为什么转染了mimics的细胞的形态都是纤维化的摸样,而没有 ...

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【求助】磷酸化蛋白鉴定 蛋白提取 磷酸酶

咪咪土拨鼠 各位大侠好,我是外科学的医学生,现在在实验,提的问题很弱智,大家勿拍。我做目的蛋白的western, 发现其在处理组有明显的分子量漂移,初步推测其为磷酸化改变---因为再同时加了一种激酶的抑制剂后,这种漂移消失了。但问题是,怎么证明它确实是磷酸化呢?我查了查文献,目前常用的是放射性P实验和质谱分析什么的,但这对于我们的条件和经费来说,似乎不太可能。我的问题:1. 是否可以在用RIPA裂解液提总蛋白时,加入蛋白磷酸酶(大 ...

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【求助】TUNEL检测不到凋亡的原因有哪些?

roy2929 小弟新手 实验等等都不怎么懂,希望高手们帮忙。做TUNEL检测凋亡,除了本身没有发生凋亡和实验操作原因,还有什么可能会没有信号?比如通过其他不能用TUNEL检测到的方式发生了凋亡?不胜感激qwer_214 TUNEL是一种很特异的检测凋亡的方式,它主要检测DNA特异性的断裂,恕我资历比较浅,我到目前还没有发现其他用TUNEL检测到的方式发生了凋亡。roy2929 qwer_214 wrote:TUNEL是一种很特 ...

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【求助】细胞培养提RNA

cynthia_rui 求助!!!细胞转到6孔板培养后长得一直很慢,目前贴壁50%左右,能提RNA不?是不是一定要等到长到80%才能提啊?有没有什么具体的操作办法让细胞在胰酶消化时损失小一点?请各位大侠指导,感激不尽!selleckchem01 1,六孔板的细胞长到50%会有点少,不过如果很着急也是可以提取的2,楼主可以用PBS洗掉培养基后,不用胰酶消化,直接在六孔板中加入trizol裂解~zitong1983 selleckc ...

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【求助】信号转导通路

aoe3721 请问 在信号转导过程中 参与信号转导的各种蛋白与通路激活前相比有什么变化啊。其在细胞内的含量会发生改变吗。还是仅仅是发生蛋白结构上的改变。谢谢。selleckchem01 两种情况都可能发生~细胞内含量变化的例子:当Wnt蛋白于细胞表面Frizzled受体家族结合后的一系列反应,包括Dishevelled受体家族蛋白质的激活及最终细胞核内β-catenin水平的变化。 Dishevelled (DSH) 是细胞膜相关W ...

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【求助】请教什么是mRNA的poly(rC)序列?

meilixue 如题。poly(rC)中的r代表什么?谢谢。terryxiaolei r代表RNA上的胞嘧啶,即核糖核酸胞嘧啶,不带r的是脱氧核糖核酸胞嘧啶呗……poly(rC)即为多聚胞嘧啶xuezhishui 我觉得poly (rC)应该就是polyribocytidylic acid的缩写,同样的poly (rI)就是polyriboinosinic acid的缩写。其中r代表ribo。不知对否?本文由丁香园论坛提供,想了解更多有用的 ...

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【求助】wnt信号通路关键分子表达无法解释现象求助

zhangyinghua8106 研究A药处理对经典Wnt/beta-catenin信号通路的影响,结果发现A处理以后gsk-3 beta 总蛋白量减少,磷酸化gsk-3 beta也减少,而beta-catenin总蛋白增加,磷酸化beta-catenin也增加,这该怎么解释呢?不能说明beta-catenin的增加是由于gsk-3bata的减少吧?我该怎么解释这两个分子之间的关系呢?焦急等待中!望高手指点,谢谢了!!zhangyi ...

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【求助】关于BSA-AGE(晚期糖基化终产物)透析问题!

吃鱼不吐刺 有哪位前辈制备过AGE-BSA?我制备的AGE-BSA三个月已经出现明显褐色,但是由于不知道如何透析,及怎样测定制备的AGE浓度,实验一直不能进行……哪位战友能够告知下,不胜感激johnchen416 你是如何做的?透析可选用密理博的透析袋,孔径接近但必须小于白蛋白分子量67kd就可以了。用透析袋装AGEs-BSA,封闭严实,放在PBS液中,磁力搅拌器搅拌过夜即可。如果费用可以,可以直接买管子低温超速离心。su ...

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【求助】急!慢病毒包装

hetingcopy 大家好,我现在正在做慢病毒包装,用的是CLONTECK的包装系统,第一次感染293T细胞后,荧光很亮,48H后收集病毒上清,离心后冻于-80度,一天后感染靶细胞,什么都没有?请问大家是怎末做的?谢谢。大鹏鸟 看到荧光并不代表包装成功,它代表的只是你的质粒转进去了。做慢病毒包装时必须要搭配好几个质粒的比例。转染之后要能看到细胞形态的病变。收集上清的时候要注意尽快分装保存。有可能的话最好把细胞也裂解一下, ...

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【求助】western转膜问题

涛声依旧神游天下 你好,我想问下,对于转膜,干转,半干转,湿转,它们适应的分子量是多大的蛋白呢?比如我的目的蛋白是192KD,那么用哪种转膜方式较好呢?什么条件?依据是什么呢?谢谢cfss0925 现在一般都选择湿转的吧。selleckchem01 需要湿转3H以上,这么大的分子半干很难转过去;如果蛋白丰度有比较低的话,基本是检测不出来的~cherrycherry 湿转,90V,120min,依据不同转膜液配方,转膜时间可能有所不同 ...

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【求助】关于miRNA的引物设计5P臂3p臂的选择

86964109 请教大家,如果想检测某种miRNA的表达,而miRNA本身有5p和3P两种成熟体,那我设计引物是需要针对两种成熟体都设计么?还是任意一个都可以呢?谢谢!!行云流水19880112 现在我也有同样的困惑,不知您最后是怎么确定的???谢谢biohh 自己设计有点难度,很容易就把pre-miRNA检测出来了,建议你购买一些公司里设计好的引物那样比较好操作结果可信些!他们的引物是分3p和5p的。jmj_011 但是3p ...

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【求助】mTOR/Stat3这个细胞通路是否行得通?

wudan821 最近一直在研究mTOR信号通路,看了很多文献发现这个信号通路是目前抗肿瘤的热点,很多文献已经明确指出mTOR的下游分子是P70S6K和4EBP1,但是在这 两个下游分子后就很少有人去研究了,我对这个信号通路也只是了解个皮毛,想求助战友谁知道在这两个下游分子之后还能研究什么?这两个下游分子是这个信号通路的终结吗?我最近看了很多信号图谱,发现JAk-PI3K-AKT-mTOR-STAT3这一信号通路,这 ...

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【求助】cAMP的测定

dangyonghui2 大侠们,我现在用的是promega公司的cAMP测定试剂盒,按照说明书上面要求做的标准曲线,可是我做了几次出来和说明书上面都不一样,是怎么回事?求解!!!现在有测cAMP的同志们一起讨论下,我的Q:1186130200bianbenjamin 我们用的是PE的盒子LANCETM cAMP 384Kit(PE公司)1.检测原理:该试剂盒是一种时间分辨的荧光共振能量转移免疫分析,该反应是一个竞争免疫反应,即 ...

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【求助】请教关于在国内购买ATCC细胞系的问题

mahaizhi 各位前辈,请教一下在国内能不能购买到ATCC的原装细胞,有没有哪家公司或者什么机构是ATCC在国内的指定代理。如果有的话,请不吝赐教联系方式。谢谢。ddh382 我也想知道veimojie ATCC 在中国的总代理是北京中原公司 比较放心 都是ATCC原装干冰包装发给客户 有兴趣可以去公司主页看看 网址http://www.sinozhongyuan.com/index.aspxiaojianmao 同中原,我们上回说要定一个, ...

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【求助】设计引物

z1206 小女子想请教一下园子里的各位战友们,除了上海生工还有哪家生物公司可以帮忙设计PCR引物啊?或者园子里哪位大侠可以帮忙呢?我一对引物,自己设计后没结果,请上海生工帮忙设计,他们也说太难,设计不出来,所以形势很严峻啊,拜托各位了!~~~~~~~zjubell 尽量自己设计引物,再不行,让师兄姐帮忙。失败的过程也是自己学习的过程。连引物都不会设计的硕士毕业生,呵呵,不说了。selleckchemcials 设计引物时首先可以查 ...

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【求助】谁有pJim19 vector map and it's sequence

dery 谁有pJim19 vector map and it's sequence呢,贡献一下吧!!!!freecell 耶鲁大学的邓教授实验室有此质粒。可以写信求助:Xing Wang Dengxingwang.deng@yale.edu版主dachong99留言:欢迎前辈常来坐坐...dery 请问你有这方面的信息吗,网上怎么找不到?seank 扣扣1843439339本文由丁香园论坛提供,想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实验方法的你,都可以 ...

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【讨论】western blot 的疑问

anlise 刚做的western,跑分离胶时发现mark的条带被拖长了,原来的线性条带变成了长方形。考虑哪些方面的原因呢?selleckchemcials 1. 可能是电流太强了, 可以考虑把电压调低一点~2. 分离胶浓度有点低,可以考虑把换成高浓度的胶~做实验的时候,为了得到漂亮的图,一定不要介意多花时间~我有的时候为了让条带好看,170KD的蛋白都用12%的胶,跑上3小时呢~当然也可能是marker质量不好,还是果断换掉比较好~ ...

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【讨论】血浆microRNA定量

mirror122 大家好,我从中山大学发表的论文中看到,他们没有提取RNA,而是直接用特异的引物对其中的microRNA进行反转录,然后再做定量PCR,不知道大家有人用过这种方法吗?可行吗?haidaweishengwu 我也在座microRNA的提取,有机会交流一下mirror122 好呀,不知道你是怎么提取RNA的?huahuaxxh66 现在检测血浆microRNA都很昂贵,请问国内目前有没有相对合适的方法吗?或者哪 ...

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【求助】血浆提取RNA方法

mirror122 请问大家谁做过从血浆中提取总RNA 包括microRNA,我要对里面的microRNA进行定量检测。请教一下实验方法,哪个公司的试剂盒比较好。谢谢!906003500 takara 或者 英潍 都挺不错的。2004112841 我们用的是MRI的TRI REAGENT BD,货号是TB-126,做的还可以,也有文献用这个。clothilde 2004112841 wrote:我们用的是MRI的TRI REAGENT BD,货号是TB-126, ...

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