体外培养的细胞直接生活在培养基中，因此培养基应能满足细胞对营养成分、促生长因子、激素、渗透压、pH等诸多方面的要求。营养成分 1. 氨基酸：所有细胞都需要12种必须氨基酸：缬、亮、异亮、苏、赖、色、苯丙、蛋、组、酪、精、胱氨酸。2. 单糖：六碳糖是主要能源，也是合成某些氨基酸、脂肪、核酸的原料。细胞对葡萄糖的吸收能力最高，半乳糖最低。 体外培养动物细胞时，几乎所有的培养基或培养液中都以葡萄糖作为必含的能源物质。3. 维生素：生物素、叶酸、烟酰胺、泛酸、吡哆醇、核黄素、硫胺素、维生素B12都是培养基常有的成分。4. 无机离子与微量元素：细胞生长除需要钠、钾、钙、镁、氮和磷等基本元素，还需要微量元素，如铁、锌、硒、铜、锰、钼、钒等。促生长因子及激素 各种激素、生长因子对于维持细胞的功能、保持细胞的状态（分化或未分化）具有十分重要的作用。有些激素对许多细胞生长有促生长作用，如胰岛素，它能促进细胞利用葡萄糖和氨基酸。有些激素对某一类细胞有明显促进作用，如氢化可的松可促进表皮细胞的生长，泌乳素有促进乳腺上皮细胞生长作用等。渗透压 细胞必须生活在等渗环境中，大多数培养细胞对渗透压有一定耐受性。人血

第一链 cDNA合成的起始可以使用三种不同的方法，各种方法的相对特异性影响了所合成cDNA的量和种类。 随机引物法是三种方法中特异性最低的。引物在整个转录本的多个位点退火，产生短的，部分长度的cDNA。这种方法经常用于获取5‘末端序列及从带有二级结构区域或带有逆转录酶不能复制的终止位点的RNA模板获得cDNA。为了获得最长的cDNA，需要按经验确定每个RNA样品中引物与RNA的比例。随机引物的起始浓度范围为50到250ng每20μl反应体系。因为使用随机引物从总RNA合成的cDNA主要是核糖体RNA，所以模板一般选用poly（A）+RNA。 Oligo（dT）起始比随机引物特异性高。它同大多数真核细胞mRNA 3’端所发现的poly（A）尾杂交。因为poly（A）+RNA大概占总RNA的1%到2%，所以与使用随机引物相比，cDNA的数量和复杂度要少得多。因为其较高的特异性，oligo（dT）一般不需要对RNA和引物的比例及poly（A）+选择进行优化。建议每20μl反应体系使用0.5μg oligo（dT）。oligo（dT）12-18适用于多数RT-PCR。

免费分子生物学软件 互联网上有许多免费分子生物学软件，一些是在线使用的，也有一些可以下载在PC机上使用。 (一)质粒作图软件(P1asmidProcessor) PlasmidProcessor是一种免费绘制质粒图软件，可以绘制线状或环状DNA。用户定义限制位点、基因段与多克隆位点，还可插入或删除DNA片段，支持剪贴板、打印和存盘功能。 (二)蛋白质分析软件(AnTheProt) AnTheProt包括蛋白质研究领域的大多数内容，功能非常强大。应用此软件包，使用个人电脑，便能进行各种蛋白质序列分析与特性预测，包括：进行蛋白 质序列二级结构预测；在蛋白质序列中查找符合PROSITES数据库的特征序列；绘制出蛋白质序列的所有理化特性曲线；在互联网或本地蛋白质序列数据库中查找类似序列；计算蛋白质序列相对分子质量，计算蛋白质序列滴定曲线与等电点及计算信号肽潜在的断裂位点等许多功能。 (三)DNA分析软件(DNAT001) DNATool是一个可免费使用3个月的DNA序列分析软件，3个月后需交费注册才能继续使用。其功能有：序列编辑与类似序列查找，

表观遗传学中组蛋白的修饰 染色质是由DNA双链缠绕组蛋白和非组蛋白形成。基因表达的中心问题之一是，各种转录因子与RNA聚合酶是如何接近紧密包裹在染色质中DNA的。组蛋白乙酰化后，染色体处于开放状态而利于转录，并上调基因的表达。组蛋白乙酰化是一个动态过程，乙酰化和去乙酰化处于动态平衡状态。催化组蛋白乙酰化的酶是组蛋白乙酰转移酶(histoneacetyltransferases，HAT)，催化组蛋白去乙酰化的酶是组蛋白去乙酰酶(histonedeacetylase，HDAC)。现在较公认的是，具有HAT活性的蛋白质是转录激活因子，具有HDAC活性的蛋白质是转录抑制因子。基因转录是一个多因子参与的复杂过程，而转录调控的特异性是由一些能与特定的DNA序列结合的转录因子决定的。这些转录因子与DNA结合后，可以募集一些转录共激活因子，从而影响基本转录系统及染色质结构，最终影响转录。转录共激活因子是有重要的作用，它们可以整合不同的转录因子传来的信息，并决定转录的最终水平。染色体的结构变化在基因的表达调控中同样起着重要的作用。染色体中的组蛋白去乙酰化可使染色体的结构更加致密，从而抑制基因的转录

PCR引物设计的11条黄金法则一、引物最好在模板cDNA的保守区内设计。DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。二、引物长度一般在15~30碱基之间。引物长度（primer length）常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。三、引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。四、引物3′端要避开密码子的第3位。如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的

Hoechst 33258 Assay Kitfor Mycoplasma DNA 使用说明书 一、原理： 利用荧光染料（bisbenzimide，Hoechst33258）检测支原体污染。这种染料会结合到DNA的A-T富集区域，因为支原体的DNA中A-T含量高（55%~80%），所以可将其染色而被检测到。被支原体污染的细胞经染色后在细胞周围可看到许多大小均一的荧光小点，即为支原体的DNA染色斑，说明有支原体污染。 二、试剂盒组分： 1、Hoechst33258工作液50ml 2、固定液50ml 3、封固液10ml 4、说明书1份 三、未提供的设备及耗材： 1、荧光显微镜 2、6孔细胞培养板 3、22×22mm盖玻片 4、载玻片 四、操作步骤： （一）、贴壁细胞： 1、被检细胞接种在无菌的6孔细胞培养板中，接种密度为1~undefined104。同时，接种正常无支原体感染的同种细胞，作为阴性对照。 2、

反式作用因子转录激活域转录激活域(activatingdomain)由30～100个氨基酸残基组成。根据氨基酸组成特点，转录激活域分为酸性激活域、谷氨酰胺富含区域及脯氨酸富含区域。转录激活结构域一般由20―100个氨基酸残基组成。如GAL―4分子中有2个这种结构域，分别位于多肽链的第147～196位和第768―881位；GCN―4的转录激活结构域位于多肽链的第106―125位。(1)酸性α螺旋(acidicα―helix)：该结构域含有由酸性氨基酸残基组成的保守序列，多呈带负电荷的亲脂性。螺旋，包含这种结构域的转录因子有GAL―4、GCN―4、糖皮质激素受体和AP―1／Jun等。增加激活区的负电荷数能提高激活转录的水平，可能是通过非特异性相互作用与转录起始复合物上的TF―IID等因子结合生成稳定的转录复合物而促进转录。(2)谷氨酰胺丰富区(glutamine―richdomain)：SP―1的N末端含有2个主要的转录激活区，氨基酸组成中有25％的谷氨酰胺，很少有带电荷的氨基酸残基。酵母的HAP―l、HAP―2和GAL―2及哺乳动物的OCT―1、OCT―2、Jun、AP―2和SRF也含有

一、饲料营养成分及其营养作用１、人们把生物从外界摄取维持自身生命所必需的物质及其消化、吸收和排泄过程称为营养(nutrition)。而人类饲喂给的营养物质称为饲料(feedstuff),对食物或饲料中所包含的各种营养物质则统称为营养素（nutrients）。自然界中的各种物质均由化学元素所组成，在已知的一百多种元素中，至少有26种为动物所必需，这些元素绝大部分以化合物的形式存在。目前已清楚了解到，动物需要的营养物质达数十种，可以概括为七大类，即蛋白质、脂肪、碳水化合物、矿物质、维生素、纤维素和水。虽然这些物质在各种饲料中的含量有所不同，但其对实验动物的营养作用是一致的。它们各具有独特的营养功能，在机体代谢过程中又密切联系，共同参加、推动和调节生命活动。水及其营养功能水对于动物生存的重要性仅次于氧气，没有水的存在，任何生命活动都无法进行。大部分饲料均含有水分，但不同的种类含水量差异很大。对于植物性饲料，同一种原料由于收割期不同、利用部位不同、加工方法及贮存时间的不同，其水分的含量也不尽相同。动物对水的需要量受多种因素的制约，如动物种类、年龄、生长性能、环境温度湿度等，因此无法规定动物的需

1、概述人们在实践中早已总结出不同颜色的物质具有不同的物理和化学性质。根据物质的这些特性可对它进行有效的分析和判别。由于颜色本就惹人注意，根据物质的颜色深浅程度来对物质的含量进行估计，可追溯到古代及中世纪。1852年，比尔（Beer）参考了布给尔（Bouguer）1729年和朗伯（Lambert）在1760年所发表的文章，提出了分光光度的基本定律，即液层厚度相等时，颜色的强度与呈色溶液的浓度成比例，从而奠定了分光光度法的理论基础，这就是著名的比尔朗伯定律。1854年，杜包斯克（Duboscq）和奈斯勒（Nessler）等人将此理论应用于定量分析化学领域，并且设计了第一台比色计。到1918年，美国国家标准局制成了第一台紫外可见分光光度计。此后，紫外可见分光光度计经不断改进，又出现自动记录、自动打印、数字显示、微机控制等各种类型的仪器，使光度法的灵敏度和准确度也不断 提高，其应用范围也不断扩大。紫外可见分光光度法从问世以来，在应用方面有了很大的发展，尤其是在相关学科发展的基础上，促使分光光度计仪器的不断创新，功能更加齐全，使得光度法的应用更拓宽了范围。2、应用2.1 检定物质根据吸收光谱图

重组DNA转化受体细胞后，须在不同水平上进行筛选，以区别转化子与非转化子、重组子与非重组子以及鉴定所需的特异性重组子。在转化过程中，并非每个受体细胞都被转化；即使获得转化细胞，也并非都含有目的基因，所以需采用有效方法进行筛选。筛选的方法包括根据遗传表型筛选、限制性内切酶分析筛选、核酸探针筛选、PCR筛选等。本实验采用遗传表型筛选中的抗生素平板筛选或α互补筛选的方法。一、抗生素平板筛选 【实验原理】 目标基因是Kan的抗性基因，而载体含Amp 的抗性基因，因此在含有Amp 和Kan的培养基中生长的菌落即为阳性菌落。【操作步骤】 1．制备含有Amp 和 Kan 的LB琼脂培养板2．将100μl 转化菌液用无菌涂布器均匀涂布于含有Amp 和Kan培养板上，37℃培养12-16h 。3．在含有Amp和Kan培养板上能生长的菌落即为阳性重组质粒。并将其接种于含Kan的LB液体培养基2ml中培养8-16h。4．小量制备质粒，限制性酶切分析进一步鉴定。二、α互补筛选 【实验原理】 适用于含有半乳糖苷酶基因（LacZ）的载体，如 pUC系列等，其原理是：载体含有LacZ的调控序列和N端146个氨基酸的

geniusma问：准备做hepg2的转染试验了，实验室常用的的是lipofectamine 2000，听说hepG2的转染效率很低，并且这种细胞比较容易成团，这会影响转染效率吗？是否用trypsin+EDTA可以使其成为单个细胞不成团？哪种转染方法更适合hepg2?需要改用电转吗？如果用lipofectamine 2000，加入的比例如何?请有经验的朋友告知详细情况，谢谢！丁香园网友starry913认为：HepG2用lipo2000在我们实验室做的转染效率很高的，可以到70－80%，不必担心。不需要用电转，磷酸钙法也可以有40－50%的操作上主要注意：1，细胞铺板时的状态很重要，应该在铺板前尽量消化为单细胞悬液，trypsin＋EDTA充分吹打即可2，转染前1天铺板，待转染时密度刚好达到80－90%，不能太低，但是也不能长过（细胞成团，堆积）。最好是刚刚长满，此时还在对数生长期3，加入的质粒要去除内毒素，plasmid：lipo约为1：0.5-1：5。实际上采用说明书的推荐量就很好，1：2.54，用前自己好好看一遍说明书，哈哈丁香园网友yangea认为：HepG2细胞的确相对于CH

一、原理还原型抗坏血酸（AsA）可以把铁离子还原成亚铁离子，亚铁离子与红菲咯啉（4,7-二苯基-1,10-菲咯啉，BP）反应形成红色螯合物。在534nM波长的吸收值与AsA含量正相关，故可用比色法测定。脱氧抗坏血酸（DAsA）可由二硫苏糖醇（DTT）还原成AsA。测定AsA总量，从中减去还原型AsA，即为DAsA含量。二、仪器与用具离心机；分光光度计；研钵；试管。三、试剂5%三氯乙酸（TCA）；20%TCA；无水乙醇溶液；0.4%磷酸－乙醇溶液；0.5%BP－乙醇溶液；0.03%FeCl3－乙醇溶液；0.6g/L DTT；Na2HPO4－NaOH溶液：以0.2mol/L Na2HPO4和1.2mol/L NaOH等量混合；60mmol/L DTT－乙醇。四、方法1. 制作标准曲线配制浓度为2mg/L，4mg/L，6mg/L，8mg/L，10mg/L，12mg/L，14mg/L的AsA系列标准液。取各浓度标准液1.0ml于试管中，加入1.0ml 5%TCA、1.0ml乙醇摇匀，再依次加入0.5ml 0.4%H3PO4－乙醇、1.0ml 0.5%BP－乙醇、0.5ml 0.03%FeCl3

学过化学，懂点生物高中：某同学浓硫酸和铜反应，煮了十多分钟没反应过来问我，怎么还没变化啊，我一看，这货没放铜，会考的卤素实验，溴水不够了，倒霉的是县里面就一个卖试剂的，也没储备，于是出损招，配氯化铁溶液，然后每瓶滴一点溴水，反正置换碘，颜色味道现象全一样，直到高中毕业他们都不知道当时是被这么忽悠的。准备蛋白质变性实验，苏老师买了两斤鸡蛋，鸡蛋清配成蛋白液了，鸡蛋黄直接用酒精锅烤着吃了，盐是自己带的，没用氯化钠。结婚用的大气球，制备了一点氢气，明显不够大，然后看到碳化钙了，气球里面灌点水，出口处放了一个试管，里面碳化钙，绑紧了，水一过来，瞬间变大。然后晚上偷偷的拿出去下面一根绳，边上绑上一根烟，上天了，然后一个很大很大的火球，一直很庆幸当时是放上去的。铝热反应，我拌固体的时候加了点高锰酸钾，结果反应有点剧烈，喷的到处都是铁水。赶上非典了，在实验室盐酸+氯酸钾制氯气然后做消毒液，结果胶管不给力，整栋实验楼一股氯气的味道。大学时代：某有机实验，之前8小时，做了半个学期了（实验都是自己选的时间）老师突然给制备过程了，后面的人俩小时搞定玻璃工，老师告诉我们，刚烧完的玻璃不要裸手摸，因为烫

一、贴壁细胞 1. 取普通洁净盖玻片于70%乙醇中浸泡5分钟或更长时间，无菌超净台内吹干或用细胞培养PBS或0.9%NaCl等溶液洗涤三遍，再用细胞培养液洗涤一遍。将盖玻片置于六孔板内，种入细胞培养过夜，使约为50%-80%满。 2. 刺激细胞发生凋亡后，吸尽培养液，加入0.5 ml固定液，固定10分钟或更长时间（可4℃过夜）。 3. 去固定液，用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟，吸尽液体。洗涤时宜用摇床，或手动晃动数次。 4. 加入0.5 ml Hoechst 33258染色液，染色5分钟。也宜用摇床，或手动晃动数次。 5. 用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟。 6. 滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，尽量避免气泡。使细胞接触封片液，切勿弄反。 7. 荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。 二、悬浮细胞 1. 离心收集细胞样品于1.5 ml离心管内，加入0.5 ml固定液，缓缓悬起细胞，固定10分钟或更长时间（可4℃过夜）。 2. 离心去固定液，用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟。洗涤期间手动晃

垂体前叶分泌的促甲状腺激素（Thyroid Stimulating Hormone, TSH）的相对分子质量约为25000–28000，与腺垂体分泌的卵泡刺激激素（Follicle Stimulating Hormone, FSH）、黄体生成素（Luteinizing Hormone, LH）以及胎盘分泌的人绒毛膜促性腺激素（human Chorionic Gonadotropin, hCG）一样均为异源二聚体糖蛋白激素。这些激素由非特异性的α亚基与特异性的β亚基以非共价键联结而成。TSH的β亚基决定了其生物学的特性，并且它可能也是激素合成的限速步骤。一般异源二聚体糖蛋白激素的循环水平，以及其活性和作用时间均受翻译后糖基化修饰所调节。TSH是调控甲状腺细胞生长和甲状腺激素合成、分泌的主要因子。生理上下丘脑分泌的促甲状腺释放激素（Thyrotropin Releasing Hormone, TRH）和垂体分泌的TSH调控甲状腺滤泡上皮细胞合成和分泌甲状腺激素，即甲状腺素（Thyroxine, T4）和三碘甲状腺原氨酸（Triiodothyronine, T3）。TSH分泌受下丘脑–垂体–

QuickAntibody系列免疫佐剂是由北京康碧泉公司研发的一类具有自主知识产权、独特配方的新型免疫佐剂，专业用于制备小鼠单克隆和多克隆抗体。 与常规使用的弗氏佐剂的比较 QuickAntibody佐剂特色详解： 1、为什么无需乳化？ QuickAntibody系列佐剂为水溶性佐剂，抗原与佐剂仅需用移液器吹打几下，即可混匀；弗式佐剂为油性佐剂，需要繁琐的乳化，形成油包水的稳定结构。因此与弗式佐剂繁琐的乳化相比，QuickAntibody佐剂可节省大量时间与精力。2、免疫周期短？QuickAntibody佐剂有二周快速小鼠多抗制备佐剂、三周快速小鼠单多抗制备佐剂以及五周标准小鼠单多抗制备佐剂三种。若多抗即可满足客户需求，可以建议客户制备小鼠多抗，使用我们的佐剂最快仅需2周即可制备高滴度的小鼠多抗，最慢也只需5周即可制备成功，比常规弗式佐剂8周的制备时间相比，可节省3-6周的时间，从而大大提升了客户实验效率；若客户制备单抗，可以使用我们三周佐剂或五周佐剂，与常规使用弗式佐剂免疫时间8周相比，可以节省3-5周时间，也大大提升了客户实验效率，同时也节省动物饲养成本。 3、抗原用

1. Q：要做胃粘膜组织的DNA含量及倍体检查，但取材后要等几个星期才会做流式细胞术检查，请问：胃组织要怎样保存好呢？用低温保存，还是用乙醇固定？或者固定后再低温下保存？A：我做过乳腺细胞的DNA含量测定，取得组织以后，先处理成单细胞悬液，然后再加70%冰乙醇固定，要保证冰乙醇的最终浓度为50%，这样固定的细胞悬液可以至少保存12小时，最多可保存一个月，上机检测前再加PI综合染液。我就是这样做的，保存了将近三个星期，结果还可以，变异系数为5%.2. 实验中想用PI分析细胞周期及凋亡率，请教几个问题：Q：（1）所用的RNAs酶用什么配制呢？用PBS配吗？A：RNaseA用PBS配制没有问题，但是注意要沸水浴去除DNase的活性。Q：（2）测细胞周期和凋亡率时都要用RNAs酶，可以一起检测吗？A：用流式细胞仪测定时细胞周期和凋亡率是同时测定的，不用担心。Q：（3）TritonX-100是固定剂吧，用了70%的冷乙醇（是4℃吗？），是不是就不用Triton X-100固定了？A：Triton X-100是起透化作用的，不是固定剂，可以用75%的乙醇于-20度固定。Q：（4）还要设什么内参标准

1、问：请问有人养过CHO细胞吗？文献报道说用DMEM培养基来养，但我不太清楚具体是高糖还是低糖？ 参考见解：CHO细胞用高糖DMEM养就可以了，比较好养，10%血清，小牛和胎牛都可以，长得比较慢，跟你所用的血清有一定的关系，大概需要两天传一次代。在塑料板上比玻璃板上好养，感觉如果在玻璃板上养而且不包被的话，好像细胞不易伸展开来。2、问：要转染钾通道pcDNA3.1入细胞，是选cho细胞呢还是hek293细胞？cho细胞转染效率高吗？参考见解：表达一个蛋白的时候，首先要确认你的蛋白确实表达了，因为有很多原因可以导致蛋白表达出问题（质粒序列有错误，质粒纯度低，表达的蛋白不稳定，转染效率太低等）。所以在做任何功能性实验之前，必须要先确认蛋白的表达，通常的实验有：（1）采用免疫荧光法。由于需要荧光二抗，比较贵。但直观，可以确定转染效率，采用好的显微镜时，可以大致知道表达蛋白在细胞中的位置。（2）WESTERN-BLOT。可以确认表达的蛋白分子量，以及表达的量。但不直观。（3）构建一个N或C端带荧光蛋白的质粒。这样比较费时间，同时携带的荧光蛋（通常使用GFP）有可能干扰蛋白的正常功能。但好处是

一、生理正常值1. 临床正常生理指标值体温： 39.0℃（38.5￣39.5）呼吸数：51次／分钟（38￣60）脉搏数：205次／分钟（123￣304）血压：89.3mmHg（59￣119）红细胞数：5.6百万（4.5￣7.0）血红素：10.4￣15.6（g／100ml）血细胞容量值：33￣44％红细胞直径：7.0μ2. 白细胞正常指标值白细胞数：9000（6000￣13000）白细胞分类：嗜碱性 5.0％（2.0￣7.0）,嗜酸性2.0％（0.5￣3.5）,中性46.0％（36.0￣52.0）淋巴细胞39.0％（30.0￣52.0），单核细胞8.0％（4.0￣12.0）3. 血液比重 1.050，血容量占体重8.7％（7～10）。血沉：1￣2毫米／小时血清蛋白量：5.6（4.3￣7.0）g／100ml。二、一般生理学特性1. 家兔属于恒温动物，正常体温一般认为是38.5￣39.5℃,体温调节主要利用呼吸散热维持其体温平衡。如果外界温度由20℃上升到35℃时，呼吸次数可增加约7倍。可见，高温对家兔是有害的,如果外界温度在32℃以上,生长发育和繁殖效果都显著下降。2. 对环境温度变化的

摘要： 目前,感受态细胞的制备常用冰预冷的CaCl2处理细菌的方法制备,即用低渗CaCl2溶液在低温（0℃）时处理快速生长的细菌,从而获得感受态细菌.本方法的关键是选用的细菌必须处于对数生长期,实验操作必须在低温下进行. 原理： 目前, 感受态细胞 的制备常用冰预冷的CaCl2处理 细菌 的方法制备,即用低渗CaCl2溶液在低温（0℃）时处理快速生长的细菌,从而获得感受态细菌.此时细菌膨胀成球形,外源 DNA 分子在此条件下易形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附在 细菌 表面,通过热激作用促进细胞对DNA的吸收.转化效率可达106-107转化子/微克DNA. 本方法的关键是选用的细菌必须处于对数生长期,实验操作必须在低温下进行. 操作： 1、取