3D 活/死细胞测定的分析工作流程
EVIDENT
摘要
NoviSight 3D 细胞分析软件可通过测量体积、球形度和细胞数等参数提供有关微球和其他 3D 对象的统计数据。本应用指南将介绍用于活/死微球测定的 NoviSight 3D 细胞分析工作流程。
引言
使用微球或类器官进行 3D 高内涵分析（HCA）的难度可能很大。理想情况下，我们可以通过三维方式分析 3D 样品获得有关形态和内部条件的信息。NoviSight 软件的真实 3D 分析可通过基于连续 Z 序列荧光图像测量 3D 样品的体积、细胞数量和细胞状况，从而简化这一过程。另一方面，常规分析使用的单个图像切片（图 1，左，2D 分析）或使用投影图像（图 1，中，2.5D 分析）。这两种技术均会从 3D 样品中丢失诸如空间、形态和体积信息等大量数据（图 1）。
图 1 (从左到右)：2D、2.5D 和 3D 分析示意图。
在本应用指南中，我们介绍如何使用活/死微球测定法通过 NoviSight 软件定量分析 3D 样品。
方法
样品制备
我们在 PrimeSurface96U 孔板（Sumitomo Bakelite）中培养 500 HT-29 细胞/孔八天以形成微球，然后第二天用 NucView 550 (Biotium) 施用不同浓度的星形孢菌素（STS）。NucView 550 是 caspase-3 荧光探针，死细胞核用红色荧光染色。用 STS 和 NucView 550 处理后，将 HT-29 微球用 4% 多聚甲醛固定并用 0.5%Triton X-100 / PBS（-）通透性处理。微球的细胞核在 4°C（39.2°F）下用 Hoechst 33342 过夜染色。染色后，用 SCALEVIEW-S4 将微球透明化。
成像和分析
我们使用 FV3000 激光扫描共聚焦显微镜和半复消色差物镜（LUCPLFLN20X）在三个维度上对样品进行成像。采集条件如下所示。Z轴步进为 2μm。Hoechst 33342 使用 405 nm 激光（蓝色荧光），NucView 550 使用 561 nm 激光（洋红色荧光）。图2 显示为使用显微镜采集的未经处理和经 STS 处理的微球体积图像。未经处理经 8 天培养微球的核心区域可能因营养不足或低氧而死亡。总体而言，STS 诱导 HT-29 微球细胞死亡。
图 2：使用（右侧）和不使用（左侧）STS 的 HT-29 微球体积视图。
优点
- 轻松进行 3D 活/死活力测试
- 直观的用户界面可帮助您将 Z-堆叠图像转换为可再现的定量数据
3D 活/死微球分析策略
使用 NoviSight 软件定量分析活/死微球时，需要执行表1 中列出的步骤。为了让 NoviSight 软件能够从 Z 平面图像以三维方式识别细胞核，可将Z截面的步进设置为 3μm ，这是检测单个细胞核的最大测量值。
| 步骤 | 详细信息 |
| 样品制备 | 细胞培养和荧光染色 选项：固定和透明化 如果想要分析细胞数，则应对细胞核染色 ↓ |
| 成像 | 获取多个Z序列图像 共聚焦显微镜，多光子显微镜 ↓ |
| 分析 | 1.识别诸如细胞核、体积、细胞器等感兴趣的对象。 2.设置分析参数 3.通过圈门进行图形分析 4.统计分析 |
表 1：从样品制备到分析的 3D 分析工作流程。
NoviSight 软件分析步骤
主要对象识别
通过活/死细胞数量评估活/死细胞测定。NoviSight 软件可以从细胞核染剂中检测细胞数量。为了识别细胞核，我们使用了专门的 NoviSight 模块进行核检测：NuclearL 。在输入适当的细胞大小、背景强度和 Z / XY 比（核的 Z 轴伸长）后，NoviSight 软件就可以自动检测 3D 空间中微球细胞核（图 3A）。
分析参数设置
对于使用 Hoechst 33342 染色的所有细胞核，NucView 550 信号强度高的细胞均为死细胞。结果，NoviSight 软件能够通过已识别核对象上的 CH2（NucView 550）强度等级对活/死细胞进行分类（图 3B）。也就是说 NoviSight 软件仅使用核识别设置就可以对微球活/死细胞进行分类。
图 3：识别父母对象。（A）核被 NuclearL 模块所识别。每个被识别的核均被用彩色圆圈圈上。（B）设定分析参数。例如，参数 10 是主要对象（核）上 CH2（死信号）的最大强度。
核识别完成后，就可以在散点图或直方图中将识别出的核绘制为对象数据。散点图的 X 轴或 Y 轴可以根据分析参数进行调整。当将其分别设置在中心 X / Y 时，将主要对象的中心 X / Y 绘制在图形上（图 4A）。点击图形中的一个点时，NoviSight 软件即可指向原始图像中的相同位置（图 4B）。
图 4：微球的定量分析图像。（A）当分别在 X 和 Y 轴上设置中心 X 和 Y 分析参数（在图 3B 中设置）时，在图中绘制每个被识别的核。可以根据需要调整 X / Y 轴上的分析参数（红色正方形）。（A / B）NoviSight 软件可以将分析数据与原始图像以直观方式链接起来。点击图形中已识别核的图形（A，红色箭头）时，相同位置会在原始图像中自动显示（白色箭头）。
图 5：细胞分类的图形化分析。
（A）当分别在 X 和 Y 轴上设置分析参数平均强度 CH2（在图 3B中设置）时，该图形以 CH2（死信号）平均强度的顺序显示主要对象计数（核）。我们就可以通过 CH2 强度门控区分活细胞和死细胞。（B）以绿色显示已识别死区的体积视图。
统计分析
NoviSight 软件可以同时分析多个样品。来自分析中的定量数据可以作为热图（图 6A）显示，也可以导出为 CSV 文件用于进一步分析。数据也可以在每个门控中输出。这里的数据表明，在 HT-29 微球中处理各种浓度的 STS 时，STS 以剂量依赖的方式诱导 HT-29 细胞凋亡（图 6B）。
图 6：带有或不带 STS 的 HT-29 微球活/死细胞分析的定量结果。（A）NoviSight 软件输出每个门的定量数据。
数据也可在热图中显示。（B）STS 以剂量依赖性方式增加 HT-29 细胞死亡。
连接数据和图像
数据和图像之间的链接是高内涵分析的主要优势。与酶标仪不同，HCA 可以参考原始图像以目视方式确认细胞的形态、位置和强度。NoviSight 软件充分利用了这一功能。例如，当点击特定数据点或对象时，软件可以显示相应的图像（图 7），例如：
- 散点图上一个点
- 图片集中一张图
- 热图上一个孔
- 图表中一个数字
- 散点图上的点图像组视图中的对象图像热图上的孔表格中的数字
图 7：点击数据点或对象时，NoviSight 软件可在相应的图像上显示相同的点。
结论
3D 样品的 3D 定量分析看上去很复杂，但是 NoviSight 软件可以从头到尾让您的工作流程得到简化。例如，细胞核识别是微球活/死分析的唯一参数。这种简化工作流程也可应用于相关 3D 模型。
