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    T 细 胞 中 丝 裂 原 活 化 的 蛋 白 激 酶 （MAPK) 活 性分 析

    相关实验：T细胞中丝裂原活化的蛋白激酶 （MAPK) 活性分析

    最新修订时间：

    材料与仪器

    步骤

    基 本 方 案 1 免疫复合物蛋白激酶测定

    此方法可用于测定 E R K 、 J N K 和 p38 M A P K 的活性，也可使用针对每个 M A P K
    组分的商品化抗体。然而，特定的抗体对各组分内特定的亚型会显示一定的特异性。

    材 料

    小 鼠 T 细 胞 （每个试验0.5X 106〜I.O X l O 6个细胞；单 元 2.1) VTriton裂 解 液 （T L B ) ，冰冷的 抗 M A P K 多 克 隆 抗 体 （ Santa Cruz Biotechnology): C -14 ( E R K 2); C -17 (J N K l ) ； C -20 (p38) V 50 % (V A O 蛋 白 A -琼脂糖悬液 V 激 酶 缓 冲 液 （K B ) 2mg/ml G S T -M A P K 底 物 （见辅助方案）： GST-Elkl (310-428)，或髓磷脂碱性 蛋 白 （M B P ; Sigma) 用于 E R K 2 ， GST-cJmi (1-79)用于 J N K 1 ，或 G S T - A T F 2 (1-109)用于 p38cx/p lmmol/L A T P (Sigma; 分装保存于一20°C ) 10mCi/ml [y-32P ] A T P (6000Ci/m m o l ； Amersham Pharmacia Biotech) V 4 X S D S 凝胶上样缓冲液 1 2 % 3 0 3 士 八 0 £ 小 型 胶 （单元12.3) V 考马斯染料 V 脱色液 冷冻离心机
    振荡平板混合器 30°C和 100°C加热块 W h a t m a n 3M M 滤纸 注意：有相当 髙 比 例 的 [7-32P ] A T P 并未摻入底物，并在电泳时随着染料前沿移 动 。因此：①使染料前沿跑出凝胶底部进入电泳缓冲液，作为液态放射活性废物弃置； ②存留在凝胶底部，可用手术刀切除，在凝胶染色前作为固态放射性废物弃置。 1. 4°C ， IOOOg离 心 T 细胞悬液l O m i n， 移出上清液，并 用 IOOm I 冰 冷 T L B 小心上下吹 吸重悬沉淀物。在冰上孵育15111丨11， 4°〇， 15()0(^离心10111丨11，将上清移至新的 1.5m l 小离心管，冰上保存。 2 . 在准备细胞裂解物时，将抗体预结合在蛋白A -琼脂糖上：将 经 验 量 的 抗 M A P K 抗 体 （1〜2iug/0.5X106〜1.0X106个细胞）与 400/xlTLB 和 2 0 ^ 1 5 0 % 蛋白 A -琼脂糖 混悬物置于I.5m l 小离心管内，于振荡平板混合器上4°C 孵 育 30min。 3. 4°C ，最髙转速短暂离心5S，收集管底琼脂糖珠，吸弃上清。将结合有抗体的蛋白 A -琼脂糖凝胶洗2 次 ，每次加入Iml T L B ， 4°C ，最髙转速短暂离心5s，收集琼脂糖 珠 ，吸弃上清。 4 . 将 步 骤 1 获得的澄清的细胞裂解液加入到结合有抗体的蛋白-A 琼 脂 糖 中 ，再加入 T L B 使总容量达到400^1。在旋转平台上4°C 赙育至少3h (过夜亦可）进行免疫沉淀 反应。 5 . 用 步 骤 3 阐述的方法洗涤蛋白A -琼 脂 糖 珠 3 次 ，每 次 用 Iml T L B 。继 续 洗 2 次 ，每 次 用 Iml K B 。确保在最终洗涤完毕后，所有多余的缓冲液都被除去（无液体的紧实 珠体积应为10^1)。 6 . 在 洗 涤 （步 骤 5 ) 刚开始前或刚结束后混合下列成分以配制激酶反应混合物： K B 27iil 2m g / m l G S T - M A P K 底物 V l m m o l / L A T P Ijul 10m C i / m l [ > 52P ] A T P 0 •5/xl。 7 . 将3〇 M 1 激酶反应混合物加入到 l〇 W 由 步 骤 5 获得的无液体的蛋白A -琼脂糖珠中。 利 用 加热块于 30°C 孵 育 30min。每 IOmin轻弹管壁使内容物充分混合。最后加入 10M1 4 X S D S 凝胶上样缓冲液以终止蛋白激酶反应。 8 . 利用加热块于100°C 下将混合物加热5min。脉冲离心样本以在微离心管底部收集该 混 合 物 （步 骤 3)，并上样 到 1 2 % SD S -P A G E 小 型 凝 胶 上 （单 元 12.3)。 150V 电压 下 电 泳 lh。 9 . 用考马斯染料对凝胶染色I O m i n ，然后进行脱色直至凝胶背景变得清晰。在真空中 80°C下利用干胶仪在W h a t m a n 3M M 滤纸上将凝胶干燥l h 。 10. 确认在每一试验中底物蛋白质的水平均相同。将磷酸化的 G S T -M A P K 底物曝光在 X 射线胶片上使其显影，或者利用磷成像仪分析法对32P 与底物结合进行定量。

    基本方案 2 固相蛋白激酶法检测 J N K 活性

    这种方法最适合于测定 J N K 活 性 ，它依赖于 J N K 与它的靶转录因子 c-J u n 的 N H 2 末端活化区结合的特异性。

    材 料

    小 鼠 T 细 胞 （每个试验0 . 5X 106〜I .OXlO6个细胞；单 元 2.1) V T rito n 裂 解 液 （ TLB) ，冰冷的 5 0 % (V7 V ) 的悬浮于P B S中 的 GST-cJun (1-79) /GSH-琼 脂 糖 珠 悬 液 （辅助方 案 ，步 骤 1 ; 省略后面的洗脱步骤） V 激 酶 缓 冲 液 （K B ) lm m ol/L ATP (Sigma; 分 装 保 存 于 一 20〇 C ) 10mCi/ml [y-32P] ATP (6000Ci/mmol； Amersham Pharmacia Biotech) V 4 X SDS凝胶上样缓冲液 1 2 % SDS-PAGE小 型 凝 胶 （单 元 12. 3) V 考马斯染料 V 脱色溶液 冷冻离心机 旋转式平台搅拌器 30°C和 100°C加热块 Whatman 3MM 滤纸 I. 4°C ， IOOOg离 心 T 细胞混悬液lOmin。 弃去上清，上下吹吸使沉淀重悬于IOOmI 冰 冷 的 T L B 中。冰 上 孵 育 15min。 4°C ， 15 O O O g 离 心 lOmin， 将 上 清 移 至 一 新 的 1.5ml小离心管中，置于冰上。 2•将30/xl5 0 % GST-cjun (1-79) /G S H -琼 脂 糖 珠 悬 浮 液 （见辅助方案，步 骤 9 ) 加入 1.5m l 微离心管中。 4°C ，最 高 转 速 离 心 5s，收集管底沉淀。吸 弃 上 清 ，加 入 Iml T L B 洗涤。重 复 5s 离心及吸弃上清步骤。 3 . 将 步 骤 1 获得的澄清的细胞裂解液在总体积400/xl的 T L B 中 与 GST-cJun (1-79) / GSH-琼脂糖珠混合，利用旋转式平台搅拌器4°C孵育过夜。 4 . 次日，用 步 骤 2 中所述的方法洗涤琼脂糖珠3 次 ，每 次 用 Iml T L B 。继 续 洗 涤 2 次 ， 每 次 用 Iml K B 。确保在最终清洗完毕后，所有多余的缓冲液都被去除（紧实的珠体 积 应 为 15/xl)。 5 . 在 洗 涤 （步 骤 4 ) 刚开始前或刚结束后混合下列成分以配制激酶反应混合物： K B 19/xl lm m ol/L ATP Ijul 10mCi/ml 〇 32P] ATP 0•5/xl0 6 . 将 20M1激 酶 反 应 混 合 物 加 入 到 15M1 自 步 骤 4 获 得 的 紧 实 的 GST-cJun (1-79) / G S H -琼脂糖珠中。利用加热块于30°C 孵 育 30min。每 IOmin轻弹管壁使内容物充分 混合。最后加入l〇/xl 4 X S D S 凝胶上样缓冲液以终止蛋白激酶反应。 7 . 利用加热块于l〇〇°C 将该混合物加热5min。短暂离心以在管底收集该混合物（步骤 3)，并将之上样到1 2 % SDS-P A G E 小 型 凝 胶 上 （单 元 12.3)。 150V 电压下电泳lh。 8 . 电泳后，用考马斯染料将凝胶染色IOmiri使底物显影，然后进行脱色至凝胶背景变

    清晰。在真空中 80°C 下利用干胶仪在 Whatman 3M M 滤纸上将其干燥 lh。
    9 . 确认在每一步试验中底物蛋白质的水平均相同。将凝胶曝 光 在 X 射线胶片上使其显
    影或者利用磷成像仪分析法，对 32P 掺 入 GST-cJun (1-79) 的量进行定量。

    基本方案 3 SDS-P A G E 后原位检测 J N K 蛋白激酶活性 [「胶内」（IN-G E L )

    激酶测定]
    该方案改良自 Gotoh 等 1 9 9 0 年报道的方法。由 于 J N K 对 GST-cJmi ( 1 - 7 9 ) 具有
    高特异性，所以该方案最适合测定 J N K 活 性 。如 果 在 胶 中 加 入 GST-Elkl (310-428)
    或 M B P ，该方案也适用于检测 E R K 的活性，但 此 时 也 能 检 测 出 其 他 能 催 化 Elkl 或
    M B P 的激酶，在分析结果时应特别注意。

    材 料

    小 鼠 T 细 胞 （每个试验约0.5X I O 6个细胞；单 元 2.1) V T rito n 裂 解 液 （ TLB) ，冰冷的 GST (对照）或 GST-cJun ( 1 - 7 9 ) (辅助方案） V 4 X S D S 凝胶上样缓冲液 2 0 % (W V ) 异 丙 醇 /50mmol/L T r is * Cl， pH8.0 (附录 1) 7 缓 冲 液 A 6mol/L 盐 酸 胍 （临用前需过0.45/x m 滤器） 0 . 0 4 % (V /V ) Tween 40 (Sigma) n/ 缓 冲 液 B lm m ol/L ATP (Sigma; 等分样本一20°C 下保存） 10mCi/ml [y-32P] ATP (6000 Ci/mmol； Amersham Pharmacia Biotech) 5 % (m/V ) 三 氯 乙 酸 （TCA ) / 1 % (m/V ) 焦 磷 酸 钠 冷冻离心机 100°C 加热块 旋转式平台搅拌器 盖革计数器 Whatman 3MM 滤纸 注 意 ：有 相 当 高 比 例 的 [7-32P] A T P 并未掺入底物，仍然残留在激酶检测混合物 中，因此需要作为放射性液体废物弃置处理。 1. 4°C ， IOOOg离 心 T 细胞混悬液IOmin。移出上清液，并 用 IOO1 Ul冰 冷 T L B 小心上下 吹吸，重悬沉淀物。在冰上孵育15min， 4°C ， 15 OOOg离 心 IOmin，将上清移至一新 的 1.5m l 小离心管，置于冰上。 2 . 制 备 1 2 % 聚 丙 烯 酰 胺 小 型 凝 胶 （单 元 12.3)，凝 胶 中 包 含 0.25mg/ml GST-cJun (1-79)或 GST (对照）。 在 应 用 聚 合 剂 （TEM ED ) 前将蛋白质加 入 到 凝 胶 混 合 物中。 3 . 将 4 X S D S 凝胶上样缓冲液加入到自步骤1 获 得 的 T 细胞裂解物中，至最终浓度为 I X 。利用加热块于1Q0°C 加 热 5min。最 大 速 度 离 心 5s 收集管底部样本，将之上样
    到 步 骤 3 中制备的凝胶上， 150V 电压下电泳Ih (单 元 12. 3)。 4 . 电泳后，洗 涤 2 次除去凝胶中的SD S ，每次于室温下在1001111 20%异丙醇/50111111〇1/乙 TriS . C l (p H 8 . 0 ) 中孵育30min，同时用旋转式平台搅拌器轻微摇动。再 重 复 洗 2 次 ，用缓冲液A 代替异丙醇/50m m 〇l/LTriS。 5 . 洗涤凝胶2 次 ，每次于室温下在IOOml含 6mol/L 盐 酸 胍 （p H 8 . 0 ) 的 缓 冲 液 A 中 孵 育 30min，并进行轻微摇动使蛋白质变性。随 后 在 200m l 含 0 •0 4 % Tween 4 0 的 缓 冲 液 A 中 4°C 温和摇动过夜，其 间 要 更 换 数 次 （至 少 4 次），从而使凝胶上的蛋白 质复性。 6 . 次日，将凝胶在 25m l缓冲 液 B 中室温温和摇动30m in以进行清洗。 7 . 配制蛋白激酶测定混合物： 缓 冲 液 B 25ml lmmol/L A T P 5yl 10mCi/ml [y-52P] ATP (6000Ci/mmol) SmI0 8 . 将蛋白激酶测定混合物与凝胶于室温温和摇动，孵 育 60min。 9 . 用 200m l 的 5 % T C A / 1 % 焦磷酸钠于室温温和摇动清洗凝胶，其间更换数次，直到 凝胶边缘的放射性与背景水平相同（用盖革计数器检测；可能需要8〜 24h) 。 1 0 . 用水以漂洗凝胶数次，然 后 置 于 Whatman 3M M 滤纸上，在 真 空 中 80°C下利用干 胶 仪 在 Whatman 3M M 滤纸上将其干燥lh 。 通 过 在 X 射线胶片上曝光或者利用磷 成像仪进行分析，将磷酸化的G ST-M APK 底物显影。磷酸化条带会移往符合JNK 异构体大小的部分 （46kDa和 55kDa)

    基本方案 4 利用磷酸化位点特异性抗体检测 M A P K 的活化

    用 Biosource、 Cell Signaling Technology 及 Promega 公司的抗体均可进行如下所述
    的检测，本方案将以 Cell Signaling Technology 的磷酸化-S A P K / J N K (Thr-183/Tyr-
    1 8 5 ) 抗体为例。这一方法检测的是 M A P K 的活化作用，因此并非直接测定 M A P K 的
    活性。

    材 料

    小 鼠 T 细 胞 （每个试验 I. O X l O 6个细胞•，细胞分离技术见单元2.1) V Triton裂 解 液 （T L B ) ，冰冷的 V 4 X S D S 凝胶上样缓冲液 1 2 % SDS-P A G E 小 型 凝 胶 （单 元 12. 3) 甲醇 V W e s t e m 转 膜 缓 冲 液 （W T B ) 5 % (m /V ) 牛 血 清 白 蛋 白 （B S A ) 或 5 % (m /V ) 脱脂牛奶溶于Western印迹缓 冲 液 （W B B ) 一抗：多克隆兔抗磷酸化-S A P K / J N K (Thundefined-183/Tyr-185)抗 体 （CellSignalixig Technology) 0 •5 % (W V ) Tween 20 溶于 W B B


    二抗： H R P -偶联的抗兔 Ig (Amersham Pharmacia Biotech) V W e s t e m 印 迹 缓 冲 液 （W B B ) 冷冻离心机 100°C 加热块 Immobilon-P 转 移 膜 （Millipore) 凝 胶 印 迹 纸 （Schleicher& Schuell) : 用 W T B 浸泡 半干的 Western 转 印 仪 （Hoefer Scientific; 见单兀 12, 5) 旋转式平台搅拌器 1. 4°C ， IOOOg离 心 T 细胞混悬液lOmin。移出上清液，并 用 IOOmI冰 冷 T L B 小心上下 吹吸，重悬沉淀物。在冰上孵育15111丨11， 4°(：， 15 00(^离心1〇 111丨11，将上清移至一新 的 1.5m l 小离心管，置于冰上。 2 . 将 4 X S D S 凝 胶 上 样 缓 冲 液 加 入 到 自 步 骤 1 获 得 的 T 细 胞 裂 解 物 中 ，最终浓度为 I X 。 利 用 加 热 块 100°C加 热 5min。 最 大 速 度 短 暂 离 心 5s 收 集 管 底 样 本 ，上样到 1 2 % SDS-PAGE小型凝胶上， 150V 电压下电泳Ih (单元 12. 3 ) 。 电泳后，用 WTB 浸泡凝胶 5min。 3 . 将凝胶样大小的Immobilon-P 转移膜浸入甲醇中数秒使之浸湿，然后移入W T B 中浸 泡 5min。将凝胶和转移膜夹在两张凝胶印迹纸中间，开始免疫印迹转移。转移过程 利用半干的转印仪器（单 元 12. 5 ) 进行，在 15V 下 转 膜 3h 。 4•根据抗体类型不同，用 100m l 5 % B S A /W B B 或 5 % 脱脂牛奶/ W B B (取决于经验） 在摇摆式平台上室温温和摇动，孵 育 I h 对膜进行封闭。 5 . 用 5 % B S A /W B B 或 5 % 脱脂牛奶々 ^^8配制适当稀释度的一抗（稀释度主要取决于 经验，多采用1:1〇〇〇 )。将膜在稀释后的抗体液中4°C 温和摇动下孵育过夜。次日， 洗 膜 2 次 ，每次在IOOml 0.5% Tween 20/W B B 中洗lOmin，同样利用摇摆式平台在 室温下温和摇动。 6 . 用 5 % B S A /W B B 或 5 % 脱脂牛奶/W B B 配 制 I : 10 OOO稀释的二抗。将膜在二抗稀 释液中室温温和摇动孵育lh。洗 膜 4 次 ，每 次 在 IOOml 0. 5 % Tween 20/W B B 中洗 lOmin，同样利用摇摆式平台在室温下温和摇动。然后单独用W B B 冲 洗 5min。 7 . 利 用 E C L 试 剂 按 照 说 明 书 （同 时 见 单 元 1 2 . 5 ) 进行免疫印迹。利 用 X 射线胶片显 影适当时间来探测信号。例如，最 初 曝 光 显 影 30s〜Imin来确定信号的强度，再据 此进行二次曝光显影。

    辅 助 方 案 制 备 GST-M A P K 底物融合蛋白

    GST-Elkl (310-428) 用作 E R K 的 底 物 、 GST-cJim (1-79) 用作 J N K 的底物、
    G S T -A T F 2 (1-109) 用作 p38 的底物。

    材 料

    感受态的 (B L 21; Novagen)
    编码 G ST -M A P K 底物融合蛋白的质粒 DNA (来 自 Roger.Davis@ Umassmed.edu
    或 Alan.J.Whitmarsh @ man.ac.uk， 或 类 似 质 粒）， 或纯化的 cjun 和 ATF
    (Santa Cruz Biotechnology WL Upstate Biotechnology) 含有IOOfXgAnl氨 苄 青 霉 素 （Sigma; 储 存 液 为 lOOmg/m l 水 溶 液 ，分装保存于 一20°C ) 的 L B 培 养 基 （附 录 1) 100m m 〇l/L异丙基-P-D •硫代半乳吡喃糖苷（IPTG; Promega; 分装保存于一20°C ) V 缓 冲 液 X 含或不含蛋白酶抑制剂，冰冷的 Triton X-IOO (Sigma) 3 0 % (m/VO 谷 胱 甘 肽 （GSH)-Sepharose 4B 填 充 物 （Amersham-Pharmacia) V P B S 蛋白质浓度测定试剂盒（Bio-R a d ; 可选） 100mmol/L H E P E S , p H 8. 0 50 mmol/L 谷 胱 甘 肽 （Sigma) / 100mmol/L H E P E S ， p H 8. 0 V 缓 冲 液 D 液氮或干冰 250m l 和 2L 的锥形瓶 细菌振荡培养床 分光光度计 冷冻离心机 探头式超声破碎器（如 Branson) 50m l 圆锥底离心管 旋转式搅拌器 2m l 聚 丙 燏 层 析 柱 （Qiagen) 12kDa M W C O 透析膜 1•通过CaCl2/热 激 （Sambrook^ aZ. ， 1989)或电穿孔的方法，用编码G S T -M A P K 底 物融合蛋白的质粒D N A 转 化 B L 21 E . 感受态细菌。 2•将转化细菌的单个克隆接种于250m l 锥形烧瓶中的含100Mg/m l 氨苄青霉素的50ml L B 培养基中，置 于 37°C 振荡培养过夜。 3 . 将过夜培养物移至一个2L 锥形烧瓶中，培养体积稀释至1L ，氨苄青霉素浓度仍为 100/xg/ml。置 于 37°C 振荡培养2〜3h 至 O D 6。。达 到 0 •7。加 入 100m m o l / L 的 IPTG 原液至终浓度达到0. lmmol/L ，置 于 37°C 振荡培养2h 。 4. 4°C ， 1500g 离 心 IOmin收集菌体，弃上清。用 40m l 冰 冷 的 缓 冲 液 X (不含蛋白酶 抑制剂）洗涤细胞。再 次 U O O g 转速离心并弃上清。如果有必要，沉淀可于一80°C 保存数周。 5 . 如果沉淀已被冷冻，需在冰上解冻。然 后 用 40m l 冰 冷 的 缓 冲 液 X (含蛋白酶抑制 剂）用移液管小心地上下吹吸使之重悬。 6 . 利用超声破碎细胞，脉 冲 为 30s，共 4 次 。整个过程中细胞均置于冰上，两次脉冲间 隔 lmin。在超声裂解产物中加入Triton X -100至其终浓度达到1 % (V ， ），温和涡 旋混匀，置于冰上20111丨11。 4°〇 ,20 00(^离心20111丨11，使不溶的部分沉淀。 7•加入2ml 5 0 % GSH-Sepharose 4B 混 悬 物 （由制造商提供）到 50m l 锥底离心管中。 4°C ， IOOOg离 心 lmin，弃上清。加 入 30m l 冰冷的缓冲液X (含蛋白酶抑制剂），混
    匀 ，再 次 4 ° C ， I O O O g 离 心 lmin，弃 上 清 。将 步 骤 6 中 所 得 的 上 清 移 至 含 G S H - Sepharose的 50m l 锥底离心管中，在旋转式搅拌器中4°C 孵 育 lh。 8. 4°C ， I O O O g 离 心 lmin，弃上清。洗 4 次 ，每 次 加 入 30m l 冰 冷 的 缓 冲 液 X (含蛋白 酶抑制剂）， 4°C ， I O O O g 离 心 lmin，弃上清。 9•制备GST-cJun (1-79) /G S H -Sepharose珠 ：用 30ml P B S 冲 洗 珠 子 1 次并使之在同 样体积的P B S 中重悬。可 于 4°C 保存至数周。 如果要从G S H -Sepharose珠上洗脱 G S T 融合蛋白，则省略此步骤。 10. 分 析 GST-cJun (1-79) /G S H -Sepharose珠的部分组分以测定蛋白质浓度（用蛋白 质测定试剂盒）。或者，行 S D S - P A G E (单元12. 3 ) 后 用 考 马 斯 染 色 （单 元 12. 4)， 并与已知浓度的蛋白质相比较。 11. 将 Sepharose珠转移至2m l 聚丙烯层析柱，用 5m l 冰冷的缓冲液X 以重力的作用通 过层析柱以冲洗Sepharose珠 。再 用 2ml 100mmol/L H E P E S ， p H 8. 0 ，流过层析 柱进行洗漆。 12. 加 50m m o l /L 谷胱甘肽/lOOmmol/L H E P E S ， p H 8 . 0 , 将 G S T 融合蛋白从柱子上 的 Sepharose珠上洗脱。收集每份0. 5m l 的洗脱液至I.5m l 微量离心管内。 13. 使用蛋白质浓度检测试剂盒测定步骤1 2 的洗脱液的浓度。收集主要含有目的蛋白 的洗脱液。 14. 用 12-k D a M W C O 透析膜， 4L 缓 冲 液 D 对洗脱组分进行透析，在 4°C 下用磁性搅 拌器低速搅拌过夜。对透析的蛋白质进行SDS-P A G E 分 析 （单 元 12. 3 ) 和考马斯 染 色 （单 元 12. 4 ) 以测定蛋白质的产量和纯度。也可以根据已知蛋白质样品的浓度 评估未知蛋白质的浓度。 15•用液氮或干冰对纯化的G S T 融合蛋白组分进行快速冷冻，保存于一80°C 。 在 基 本 方 案 1 里 ，冷 冻 前 可 用 缓 冲 液 D 进 行 稀 释 或 者 用 离 心 式 浓 缩 器 （如 Nanosep 10K ， Pali) 进行浓缩，使样本來度调整到2m g /m l 待用。

    ​

    来源：丁香实验

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