植物线粒体制备及其亚结构分级分离
丁香园
2731
1. 前言
植物线粒体通过产生 ATP 为植物细胞提供能源。同时，它产生的三羧酸能为植物细胞的氮同化作用以及氨基酸合成提供充足的前体物质。有关线粒体在植物发育、生殖、育性、病敏感性及细胞程序性死亡等生理过程中的作用已有大量研究。据估计，植物线粒体内包含有 1000~1500 种蛋白质。迄今为止，已经通过蛋白质组手段鉴定了几百种蛋白质的存在。在分离线粒体的过程中，必须避免使用超渗或低渗的缓冲系统，以免线粒体破裂或变形；同时还应注意避免其他细胞组分破裂后释放出对分离完整线粒体。
2.1 植物材料
植物的任何组织都可以作为提取线粒体的材料，但是从线粒体提取的产率、纯度等方面考虑，某些特殊的植物组织更适合用于线粒体的分离。
( 1 ) 非光合的肉汁饱满的植物块根或块茎组织适合用于大规模的线粒体分离提取。但是相对产率较低（5~10 kg 新鲜组织只能提取约 300 mg 线粒体蛋白质，即 30~60 μg/g 鲜重）。这类植物主要有土豆、红薯、萝卜及甜菜等。
( 2 ) 黄化苗的各种组织，如胚轴、子叶、根及胚芽鞘，因为叶绿体少，酚类化合物也远低于绿色组织部分，用来提取线粒体时产率较高（100 g 新鲜组织大概可以提取 20 mg 线粒体蛋白质，即 200 μg/g 鲜重），并且提取的线粒体功能完备。
( 3 ) 当需要研究线粒体在光合作用中的功能时，或者所要研究的植物没有丰富的贮存器官时，就只能选取植物的绿色组织（叶片或子叶）作为材料来提取线粒体了。一般采取去除叶绿素的提取方法（产率大约为 100 μg/g 鲜 重）。
一旦用于提取的组织确定之后，就要确保这些组织不被细菌和真菌污染，因为菌体可以和线粒体一起被分离纯化下来。可以用冷水清洗多次，或者更为严格的情况下可以用次氯酸钠溶液的（14% m/V 的贮存液进行 20 倍稀释）表面灭菌 5 min。所有材料在使用前需冷却到 2~4°C。
2.2 匀浆缓冲液
为保证产率，在收集并冷却好植物组织后，应该立即匀浆开始线粒体的提取。基本的匀浆缓冲液包括 0.3~0.4 mol/L 的渗透物质（蔗糖或甘露醇) 、2~5 mmol/L 的四价阳离子螯合剂（EDTA 或 EGTA ) 、20~50 mmol/L 碱 性缓冲系统（MOPS、TES 或焦磷酸钠）、5~20 mmol/L 还原剂（半胱氨酸、抗坏血酸盐、二硫苏糖醇或 β-巯基乙醇）。还原剂应在使用之前加入。渗透物质帮助维持线粒体结构，避免其在分离过程中膨胀并破裂；缓冲系统避免因液泡破裂而导致线粒体被酸化；EDTA 可以抑制磷酸脂酶和各种蛋白酶的活性，而还原剂则有助于避免制备过程中氧化剂带来的伤害。尽管这种基本的基质系统对于从块茎组织中提取线粒体足够有效，为了更好地保护线粒体，提高制备产率，常常建议在这种基质系统中再加入一些其他的化学物质。黄化苗组织及绿色组织常常需要加入 0.2%~1% ( m/V ) BSA 以去除游离脂肪酸，2% ( m/V ) 聚乙烯吡咯烷酮（PVP ) 以去除多酸类化合物。这里列出我们常用的匀浆缓冲液的配方： 0.4 mol/L 甘露醇、5 mmol/L EGTA、50 mmol/L 焦磷酸钠- KOH (pH 7.8)、10 mmol/L 半胱氨酸，0.5% BSA 和 1% PVP- 40，适用于各种不同的组织。缓冲液可以使用前新鲜配制，也可以配好后贮存在 4°C 或 -20°C 条件下。匀浆后过滤可用平纹纱布或各种药用纱布。
2.3 清洗缓冲液
0.3 mol/L 甘露醇、10 mmol/L TES-KOH，pH 7.2，以及 0.1% ( m/V ) BSA 作为一种广泛用于各种植物组织线粒体提取的清洗缓冲液，即可用来悬浮和清洗线粒体，同时也用来配制 Percoll 梯度溶液。
2.4 Percoll 梯度溶液
用 0.3 mol/L 蔗糖或 0.3 mol/L 添加 10 mmol/L TES 的甘露醇，pH 7.2，0.1% (m/V) BSA 在使用当天配制 Percoll 梯度溶液（见注释 1、2、3) 。如果要准备连续梯度，则必须使用密度梯度制备仪（图 7-1A )；可以直接使用注射器制备非连续梯度（图 7-1B ) 。
2.5 细胞色素氧化酶活性鉴定
( 1 ) 氧消耗测定法：O2 电极，0.5 mol/L Tris-HCl，pH 7.5，5 mmol/L 细胞色素 C ( 氧化型），0.5 mol/L 抗坏血酸钠，10% ( m/V ) Triton X-100，0.1 mol/L KCN。
( 2 ) 分光光度计测定法：可见光分光光度计，PD10 脱盐柱，0.5 mol/L Tris-HCl、pH 7.5，5 mmol/L 细胞色素 C ( 还原型，见注释 4 )，10% ( m/V) Triton X-100，0.1 mol/L KCN。
2.6 线粒体各组分分级分离
不含 BSA 的清洗缓冲液（0.3 mol/L 甘露醇、10 mmol/L TES- KOH，pH 7.2 ) 、2 mol/L KCl 贮存液、低渗缓冲液（50 mmol/L 蔗糖、2 mmol/L EDTA、10 mmol/L MOPS pH 6.5)、2 mol/L 蔗糖、碳酸钠溶液（100 mmol/L Na2CO3) 以及微量匀浆器。
4. 注释
( 1 ) 硅胶质 Percoll 利于等渗梯度的形成，通过等密度离心便于通过利用线粒体的密度特性来分离该细胞器。常用的方法是通过用固定转角的转头离心 Percoll 溶液来获得密度梯度。因为多分散的胶质（平均颗粒直径约 29 nm，密度 > 2.2 g/ml ) 在大于 10000 g 的离心力下会沉降而产生梯度。Percoll 的起始浓度以及形成梯度需要离心的时间应通过试验来具体确定。
( 2 ) 根据所用植物组织材料的不同，Percoll 梯度常常需要做出相应的调整。表 7-1 列出了一些文献报道的从不同植物组织中提取线粒体所采用的密度梯度方法。图 7-1 展示如何制备这些梯度。
( 3 ) 非连续 Percoll 梯度法分离线粒体可以让线粒体富集在不同浓度的界面处，因而常常被使用。制备非连续 Percoll 梯度溶液简单易行。将附带 19 号规格针头的注射器在木架上固定（图 7-1B) 深入呈 45° 角斜插在冰上的离心管底部内侧，然后缓慢依次注入梯度溶液（从下至上）即可。只有当来自不同组织的线粒体和其他细胞器的密度经过连续密度梯度离心确定之后，才能使用非连续梯度离心。GE Health 公司已有供应不同密度的标志小珠。
( 4 ) 还原型的细胞色素 C 可以通过用 0.1 mol/L Tris-HCl pH 7.5 稀释氧化型的细胞色素 C，并加入等摩尔量的抗坏血酸来获得。这步反应可以通过测量 400~600 nm 的吸光值来观测。甚至只需用肉眼即可观测到。氧化型的细胞色素 C 呈红棕色，而还原型则呈粉红色。剩余的抗坏血酸在反应结束后必须用脱盐柱子（如 G25 或 PD10 ) 去除。所得的还原状态的细胞色素 C 可以在 -20°C 保存数周。
( 5 ) 线粒体制备必须尽可能迅速地在不超过 4°C 条件下完成，不同的离心步骤之间尽量不要有过多的停顿。匀浆和粗提物清洗间隔时间对于完整线粒体的产率具有重要影响。
( 6 ) 有些研究者在制备过程中省略了第 5 步和第 6 步。这在很大程度上取决于低速离心到底能否成功地去掉来自于细胞碎片和细胞核等部分的污染。
( 7 ) 线粒体本身的密度决定了制备该细胞器的方法和所能获得样品的纯度。当前分离比较成功的线粒体样品一般也都含有 2%~5% 的非线粒体蛋白质污染。比较理想的期望是通过增加一些步骤，使得样品中最终只含有 0.2% ~1% 的非线粒体蛋白质污染，如利用细胞器表面所带电荷或亲和捕捉技术。但是这些都还不常用。
( 8 ) 在分离外膜/膜间隙与沉淀时使用的低渗溶液中蔗糖的浓度取决于不同的材料。这种渗透势可以在 10~80 mmol/L 变化以确定最适浓度，从而保证外膜最大程度的破裂 ，而内膜最小程度的破裂。
参考文献
1. Neuburger, M. (1985) in Higher-Plant Cell Respiration, vol. 18(Douce, R. andDay, D. A., eds.), Springer-Verlag, Berlin, pp. 7-24.
2 . Douce, R. (1985) Mitochondria in Higher Plants: Structure, Function and Biogenesis,American Society of Plant Physiologists.
3. Millar, A. H., Liddell, A., and Leaver, C. J. (2001) Isolation and subfractionationof mitochondria from plants. Methods Cell Biol.65, 53-74.
4. Neuburger, M., Journet, E. P., Bligny, R., Carde, J. P., and Douce, R. (1982) Purification of plant-mitochondria by isopycnic centrifugation in density gradients ofPercoll. Arch. Biochem. Biophys. 217, 312-323.
5. Leaver, C. J., Hack, E., and Forde, B. G. (1983) Protein synthesis by isolated plantmitochondria. Methods Enzymol. 97,476-484.
6. Day, D. A., Neuburger, M., and Douce, R. (1985) Biochemical characterizationof chlorophyll-free mitochondria from pea leaves. Austr. J. Plant Physiol. 12,219-228.
7. Quail, P. (1979) Plant cell fractionation. Ann. Rev. Plant Physiol.30, 425-484.
8 . Werhahn, W., Niemeyer, A., Jansch, L., Kruft, V., Schmitz, U. K., and Braun, H.P. (2001) Purification and characterization of the preprotein translocase of the outermitochondrial membrane from Arabidopsis. Identification of multiple forms ofTOM20. Plant Physiol. 125, 943-954.
9 . Millar, A. H., Sweetlove, L. J., Giege, P., and Leaver, C. J. (2001) Analysis of theArabidopsismitochondrial proteome. Plant Physiol. 127, 1711-1727.
10 . Focke, M., Gieringer, E., Schwan, S., Jansch, L., Binder, S., and Braun, H. P.(2003) Fatty acid biosynthesis in mitochondria of grasses: malonyl-coenzyme A isgenerated by a mitochondrial-localized acetyl-coenzyme A carboxylase. PlantPhysiol. 133, 875-884.
11. Eubel, H., Jansch, L., and Braun, H. P. (2003) New insights into the respiratorychain of plant mitochondria. Supercomplexes and a unique composition of complex II. Plant Physiol. 133, 274-286.
12 . Braun, H. P., Emmermann, M., Kruft, V., and Schmitz, U. K. (1992) Cytochromecl from potato: a protein with a presequence for targeting to the mitochondrialintermembrane space. Mol Genet. Genom. 231, 217-225.
13. Logan, D. C., Millar, A. H., Sweetlove, L. J., Hill, S. A., and Leaver, C. J. (2001)Mitochondrial biogenesis during germination in maize embryos. Plant Physiol.12 5 , 662-672.
14 . Borovskii, G. B., Stupnikova, I. V., Antipina, A. I., Vladimirova, S. V., andVoinikov, V. K. (2002) Accumulation of dehydrin-like proteins in the mitochondria of cereals in response to cold, freezing, drought and ABA treatment. BMCPlant Biol. 2,5.
15. Benamar, A., Tallon, C., and Macherel, D. (2003) Membrane integrity and oxidative properties of mitochondria isolated from imbibing pea seeds after priming oraccelerated ageing. Seed Sci. Res. 13, 35-^ 45.
16. Diolez, P. and Moreau, F. (1983) Effect of bovine serum albumin on membranepotential in plant mitochondria. Physiol. Plant. 59, 177-182.
17. Eubel, H., Heinemeyer, J., and Braun, H. P. (2004) Identification and characterization of respirasomes in potato mitochondria. Plant Physiol. 134, 1450-1459.
18 . Heazlewood, J. L., Howell, K. A., Whelan, J., and Millar, A. H. (2003) Towardsan analysis of the rice mitochondrial proteome. Plant Physiol. 132, 230-242.
19 . Tanudji, M., Djajanegara, I. N., Daley, D. 0 ., et al. (1999) The multiple alternativeoxidase proteins of soybean. Austr. J. Plant Physiol. 26, 337-344.
20. Vanlerberghe, G. C. and Mcintosh, L. (1992) Lower growth temperature increasesalternative pathway capacity and alternative oxidase protein in tobacco. PlantPhysiol. 100, 115-119.
21. Norman, C., Howell, K. A., Millar, A. H., Whelan, J. M., and Day, D. A. (2004)Salicylic acid is an uncoupler and inhibitor of mitochondrial electron transport.Plant Physiol. 1 34 , 492-501.
22. Kruft, V., Eubel, H., Jansch, L., Werhahn, W., and Braun, H. P. (2001) Proteomicapproach to identify novel mitochondrial proteins in Arabidopsis. Plant Physiol.127, 1694-1710.
23. Douce, R., Bourguignon, J., Brouquisse, R., and Neuburger, M. (1987) Isolation ofplant mitochondria—general principles and criteria of integrity. Methods Enzymol.148,403-415.
24. Pastore, D., Stoppelli, M. C., Di Fonzo, N., and Passarella, S. (1999) The existenceof the K+ channel in plant mitochondria. J. Biol. Chem. 274, 26,683-26,690.
25. Glaser, E., Knorpp, C., Hugosson, M., and vonStedingk, E. (1995) Macromolecu-lar movement into mitochondria. Methods Cell Biol.50, 269-281.
26. Michalecka, A. M., Agius, S. C., Moller, I. M., and Rasmusson, A. G. (2004) Identification of a mitochondrial external NADPH dehydrogenase by overexpressionin transgenic Nicotiana sylvestris. Plant J.37, 415-425.
植物线粒体通过产生 ATP 为植物细胞提供能源。同时，它产生的三羧酸能为植物细胞的氮同化作用以及氨基酸合成提供充足的前体物质。有关线粒体在植物发育、生殖、育性、病敏感性及细胞程序性死亡等生理过程中的作用已有大量研究。据估计，植物线粒体内包含有 1000~1500 种蛋白质。迄今为止，已经通过蛋白质组手段鉴定了几百种蛋白质的存在。在分离线粒体的过程中，必须避免使用超渗或低渗的缓冲系统，以免线粒体破裂或变形；同时还应注意避免其他细胞组分破裂后释放出对分离完整线粒体。
2.1 植物材料
植物的任何组织都可以作为提取线粒体的材料，但是从线粒体提取的产率、纯度等方面考虑，某些特殊的植物组织更适合用于线粒体的分离。
( 1 ) 非光合的肉汁饱满的植物块根或块茎组织适合用于大规模的线粒体分离提取。但是相对产率较低（5~10 kg 新鲜组织只能提取约 300 mg 线粒体蛋白质，即 30~60 μg/g 鲜重）。这类植物主要有土豆、红薯、萝卜及甜菜等。
( 2 ) 黄化苗的各种组织，如胚轴、子叶、根及胚芽鞘，因为叶绿体少，酚类化合物也远低于绿色组织部分，用来提取线粒体时产率较高（100 g 新鲜组织大概可以提取 20 mg 线粒体蛋白质，即 200 μg/g 鲜重），并且提取的线粒体功能完备。
( 3 ) 当需要研究线粒体在光合作用中的功能时，或者所要研究的植物没有丰富的贮存器官时，就只能选取植物的绿色组织（叶片或子叶）作为材料来提取线粒体了。一般采取去除叶绿素的提取方法（产率大约为 100 μg/g 鲜 重）。
一旦用于提取的组织确定之后，就要确保这些组织不被细菌和真菌污染，因为菌体可以和线粒体一起被分离纯化下来。可以用冷水清洗多次，或者更为严格的情况下可以用次氯酸钠溶液的（14% m/V 的贮存液进行 20 倍稀释）表面灭菌 5 min。所有材料在使用前需冷却到 2~4°C。
2.2 匀浆缓冲液
为保证产率，在收集并冷却好植物组织后，应该立即匀浆开始线粒体的提取。基本的匀浆缓冲液包括 0.3~0.4 mol/L 的渗透物质（蔗糖或甘露醇) 、2~5 mmol/L 的四价阳离子螯合剂（EDTA 或 EGTA ) 、20~50 mmol/L 碱 性缓冲系统（MOPS、TES 或焦磷酸钠）、5~20 mmol/L 还原剂（半胱氨酸、抗坏血酸盐、二硫苏糖醇或 β-巯基乙醇）。还原剂应在使用之前加入。渗透物质帮助维持线粒体结构，避免其在分离过程中膨胀并破裂；缓冲系统避免因液泡破裂而导致线粒体被酸化；EDTA 可以抑制磷酸脂酶和各种蛋白酶的活性，而还原剂则有助于避免制备过程中氧化剂带来的伤害。尽管这种基本的基质系统对于从块茎组织中提取线粒体足够有效，为了更好地保护线粒体，提高制备产率，常常建议在这种基质系统中再加入一些其他的化学物质。黄化苗组织及绿色组织常常需要加入 0.2%~1% ( m/V ) BSA 以去除游离脂肪酸，2% ( m/V ) 聚乙烯吡咯烷酮（PVP ) 以去除多酸类化合物。这里列出我们常用的匀浆缓冲液的配方： 0.4 mol/L 甘露醇、5 mmol/L EGTA、50 mmol/L 焦磷酸钠- KOH (pH 7.8)、10 mmol/L 半胱氨酸，0.5% BSA 和 1% PVP- 40，适用于各种不同的组织。缓冲液可以使用前新鲜配制，也可以配好后贮存在 4°C 或 -20°C 条件下。匀浆后过滤可用平纹纱布或各种药用纱布。
2.3 清洗缓冲液
0.3 mol/L 甘露醇、10 mmol/L TES-KOH，pH 7.2，以及 0.1% ( m/V ) BSA 作为一种广泛用于各种植物组织线粒体提取的清洗缓冲液，即可用来悬浮和清洗线粒体，同时也用来配制 Percoll 梯度溶液。
2.4 Percoll 梯度溶液
用 0.3 mol/L 蔗糖或 0.3 mol/L 添加 10 mmol/L TES 的甘露醇，pH 7.2，0.1% (m/V) BSA 在使用当天配制 Percoll 梯度溶液（见注释 1、2、3) 。如果要准备连续梯度，则必须使用密度梯度制备仪（图 7-1A )；可以直接使用注射器制备非连续梯度（图 7-1B ) 。
2.5 细胞色素氧化酶活性鉴定
( 1 ) 氧消耗测定法：O2 电极，0.5 mol/L Tris-HCl，pH 7.5，5 mmol/L 细胞色素 C ( 氧化型），0.5 mol/L 抗坏血酸钠，10% ( m/V ) Triton X-100，0.1 mol/L KCN。
( 2 ) 分光光度计测定法：可见光分光光度计，PD10 脱盐柱，0.5 mol/L Tris-HCl、pH 7.5，5 mmol/L 细胞色素 C ( 还原型，见注释 4 )，10% ( m/V) Triton X-100，0.1 mol/L KCN。
2.6 线粒体各组分分级分离
不含 BSA 的清洗缓冲液（0.3 mol/L 甘露醇、10 mmol/L TES- KOH，pH 7.2 ) 、2 mol/L KCl 贮存液、低渗缓冲液（50 mmol/L 蔗糖、2 mmol/L EDTA、10 mmol/L MOPS pH 6.5)、2 mol/L 蔗糖、碳酸钠溶液（100 mmol/L Na2CO3) 以及微量匀浆器。
4. 注释
( 1 ) 硅胶质 Percoll 利于等渗梯度的形成，通过等密度离心便于通过利用线粒体的密度特性来分离该细胞器。常用的方法是通过用固定转角的转头离心 Percoll 溶液来获得密度梯度。因为多分散的胶质（平均颗粒直径约 29 nm，密度 > 2.2 g/ml ) 在大于 10000 g 的离心力下会沉降而产生梯度。Percoll 的起始浓度以及形成梯度需要离心的时间应通过试验来具体确定。
( 2 ) 根据所用植物组织材料的不同，Percoll 梯度常常需要做出相应的调整。表 7-1 列出了一些文献报道的从不同植物组织中提取线粒体所采用的密度梯度方法。图 7-1 展示如何制备这些梯度。
( 3 ) 非连续 Percoll 梯度法分离线粒体可以让线粒体富集在不同浓度的界面处，因而常常被使用。制备非连续 Percoll 梯度溶液简单易行。将附带 19 号规格针头的注射器在木架上固定（图 7-1B) 深入呈 45° 角斜插在冰上的离心管底部内侧，然后缓慢依次注入梯度溶液（从下至上）即可。只有当来自不同组织的线粒体和其他细胞器的密度经过连续密度梯度离心确定之后，才能使用非连续梯度离心。GE Health 公司已有供应不同密度的标志小珠。
( 4 ) 还原型的细胞色素 C 可以通过用 0.1 mol/L Tris-HCl pH 7.5 稀释氧化型的细胞色素 C，并加入等摩尔量的抗坏血酸来获得。这步反应可以通过测量 400~600 nm 的吸光值来观测。甚至只需用肉眼即可观测到。氧化型的细胞色素 C 呈红棕色，而还原型则呈粉红色。剩余的抗坏血酸在反应结束后必须用脱盐柱子（如 G25 或 PD10 ) 去除。所得的还原状态的细胞色素 C 可以在 -20°C 保存数周。
( 5 ) 线粒体制备必须尽可能迅速地在不超过 4°C 条件下完成，不同的离心步骤之间尽量不要有过多的停顿。匀浆和粗提物清洗间隔时间对于完整线粒体的产率具有重要影响。
( 6 ) 有些研究者在制备过程中省略了第 5 步和第 6 步。这在很大程度上取决于低速离心到底能否成功地去掉来自于细胞碎片和细胞核等部分的污染。
( 7 ) 线粒体本身的密度决定了制备该细胞器的方法和所能获得样品的纯度。当前分离比较成功的线粒体样品一般也都含有 2%~5% 的非线粒体蛋白质污染。比较理想的期望是通过增加一些步骤，使得样品中最终只含有 0.2% ~1% 的非线粒体蛋白质污染，如利用细胞器表面所带电荷或亲和捕捉技术。但是这些都还不常用。
( 8 ) 在分离外膜/膜间隙与沉淀时使用的低渗溶液中蔗糖的浓度取决于不同的材料。这种渗透势可以在 10~80 mmol/L 变化以确定最适浓度，从而保证外膜最大程度的破裂 ，而内膜最小程度的破裂。
参考文献
1. Neuburger, M. (1985) in Higher-Plant Cell Respiration, vol. 18(Douce, R. andDay, D. A., eds.), Springer-Verlag, Berlin, pp. 7-24.
2 . Douce, R. (1985) Mitochondria in Higher Plants: Structure, Function and Biogenesis,American Society of Plant Physiologists.
3. Millar, A. H., Liddell, A., and Leaver, C. J. (2001) Isolation and subfractionationof mitochondria from plants. Methods Cell Biol.65, 53-74.
4. Neuburger, M., Journet, E. P., Bligny, R., Carde, J. P., and Douce, R. (1982) Purification of plant-mitochondria by isopycnic centrifugation in density gradients ofPercoll. Arch. Biochem. Biophys. 217, 312-323.
5. Leaver, C. J., Hack, E., and Forde, B. G. (1983) Protein synthesis by isolated plantmitochondria. Methods Enzymol. 97,476-484.
6. Day, D. A., Neuburger, M., and Douce, R. (1985) Biochemical characterizationof chlorophyll-free mitochondria from pea leaves. Austr. J. Plant Physiol. 12,219-228.
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9 . Millar, A. H., Sweetlove, L. J., Giege, P., and Leaver, C. J. (2001) Analysis of theArabidopsismitochondrial proteome. Plant Physiol. 127, 1711-1727.
10 . Focke, M., Gieringer, E., Schwan, S., Jansch, L., Binder, S., and Braun, H. P.(2003) Fatty acid biosynthesis in mitochondria of grasses: malonyl-coenzyme A isgenerated by a mitochondrial-localized acetyl-coenzyme A carboxylase. PlantPhysiol. 133, 875-884.
11. Eubel, H., Jansch, L., and Braun, H. P. (2003) New insights into the respiratorychain of plant mitochondria. Supercomplexes and a unique composition of complex II. Plant Physiol. 133, 274-286.
12 . Braun, H. P., Emmermann, M., Kruft, V., and Schmitz, U. K. (1992) Cytochromecl from potato: a protein with a presequence for targeting to the mitochondrialintermembrane space. Mol Genet. Genom. 231, 217-225.
13. Logan, D. C., Millar, A. H., Sweetlove, L. J., Hill, S. A., and Leaver, C. J. (2001)Mitochondrial biogenesis during germination in maize embryos. Plant Physiol.12 5 , 662-672.
14 . Borovskii, G. B., Stupnikova, I. V., Antipina, A. I., Vladimirova, S. V., andVoinikov, V. K. (2002) Accumulation of dehydrin-like proteins in the mitochondria of cereals in response to cold, freezing, drought and ABA treatment. BMCPlant Biol. 2,5.
15. Benamar, A., Tallon, C., and Macherel, D. (2003) Membrane integrity and oxidative properties of mitochondria isolated from imbibing pea seeds after priming oraccelerated ageing. Seed Sci. Res. 13, 35-^ 45.
16. Diolez, P. and Moreau, F. (1983) Effect of bovine serum albumin on membranepotential in plant mitochondria. Physiol. Plant. 59, 177-182.
17. Eubel, H., Heinemeyer, J., and Braun, H. P. (2004) Identification and characterization of respirasomes in potato mitochondria. Plant Physiol. 134, 1450-1459.
18 . Heazlewood, J. L., Howell, K. A., Whelan, J., and Millar, A. H. (2003) Towardsan analysis of the rice mitochondrial proteome. Plant Physiol. 132, 230-242.
19 . Tanudji, M., Djajanegara, I. N., Daley, D. 0 ., et al. (1999) The multiple alternativeoxidase proteins of soybean. Austr. J. Plant Physiol. 26, 337-344.
20. Vanlerberghe, G. C. and Mcintosh, L. (1992) Lower growth temperature increasesalternative pathway capacity and alternative oxidase protein in tobacco. PlantPhysiol. 100, 115-119.
21. Norman, C., Howell, K. A., Millar, A. H., Whelan, J. M., and Day, D. A. (2004)Salicylic acid is an uncoupler and inhibitor of mitochondrial electron transport.Plant Physiol. 1 34 , 492-501.
22. Kruft, V., Eubel, H., Jansch, L., Werhahn, W., and Braun, H. P. (2001) Proteomicapproach to identify novel mitochondrial proteins in Arabidopsis. Plant Physiol.127, 1694-1710.
23. Douce, R., Bourguignon, J., Brouquisse, R., and Neuburger, M. (1987) Isolation ofplant mitochondria—general principles and criteria of integrity. Methods Enzymol.148,403-415.
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25. Glaser, E., Knorpp, C., Hugosson, M., and vonStedingk, E. (1995) Macromolecu-lar movement into mitochondria. Methods Cell Biol.50, 269-281.
26. Michalecka, A. M., Agius, S. C., Moller, I. M., and Rasmusson, A. G. (2004) Identification of a mitochondrial external NADPH dehydrogenase by overexpressionin transgenic Nicotiana sylvestris. Plant J.37, 415-425.
