创建重链改组噬菌体文库

[器材和试剂]

●  PCR试剂和设备

●  含有起始scFv的pHENl质粒或单链DNA（ssDNA）

●  Wlzard PCR纯化试剂盒（PrOli]egs.）

●  PdSEQl引物

●  定制BACK引物。本实验方案中，该引物是scFvVlBACK引物：5'-AGC GCC GTG TAT TTT TGC    GCG CGA CAT GAC GTG GGA TAT TGC-3'

●  用于scFv基因文库限制性消化的试剂和设备

●  BssHⅡ限制性酶（NEB）

●  用于连接scFv和pHENl DNA以及将scFv文库电转化到大肠杆菌的试剂和设备

●   来自3个VH基因片段噬菌体文库的质粒DNA

[方法]

1. 配制50ul PCR反应混合液，包含：

●  水，34.5ul

●  20×dNTP（每种5mmol/L）。  2.5ul

●  10×Vent聚合酶缓冲液，5.0ul

●  FdSEQl引物（10pmol/u1），2.5ul

●  scFvVLBACK引物（1opmol/u1），2.5/ul

●  scFv模板DNA（50ng/ul），  2.0ul

●  VentDNA聚合酶（2单位），1.0ul

2. 在有加热盖的热循环仪内加热反应物到94℃5分针。

3. 以94℃30秒、42℃30秒、72℃1分钟的条件共循环25次，扩增VH基因。

4. 用Wizard PCR纯化试剂盒纯化PCR产物。

5. 用BssHⅡ和NotI消化PCR产物。  由于用BssHⅡ替代了NcoI，因此实验方案需要调整：首先在37℃用NotI消化，再加入BssHⅡ并调整温度至50℃。

6, 制备受方VH基因片段文库载体；但用BssHⅡ/NotI消化载体，应按上述步骤5进行调整。

7. 连接已消化的VL基因片段PCR产物和已消化的VH基因片段噬菌体文库载体，并电转化到大肠杆菌TGl中，构建重链改组文库。