创建轻链改组噬菌体文库

 

[器材和试剂]

●  PCR试剂和设备

●  含有起始scFV基因的载体pHENl单链模板DNA（50ng/ul）

●  Geneclean试剂盒

●  Wlzard PCR纯化试剂盒

●  scFvJHL2XhoFOR引物：5'-GAG TCA TTC TCG TCT CGA GAC GGT GAC CAG GGT GCC-3'

●  scFvJH3XhoFOR引物： 5,-GAG TCA TTC TCG TCT CGA GAC GGT GAC CAT TGT CCC3'

●  scFvJH4-5XhoF（）R引物：5,-GAG TCA TTC TCG TCT CGA GAC GGT GAC CAG GGT TCC-3'

●  scFvJH6XhoFOR引物： 5'-GAG TCA TTC TCG TCT CGA GAC GGT GAC CGT GGT GCC-3'

●  XhoI限制性酶（NEB）  以及厂家的2号缓冲液（NEB2）

●  VL基囚文库载体

[方法]

1. 配制50ul PCR反应混合液，  包含：

●  水，34.5ul

●  20XdNTP（每种5mmol/L），  2,5ul

●  10XVent聚合酶缓冲液，5.0ul

●  LMB3引物（10pmol/u1），2.5ul

●  scF讨HXhoFOR引物（10pmol/ul），2.5ul

●  scFv模板DNA（100ng），  2.0u1

●  VentDNA聚合酶（2单位），1.0u1

2. 在有加热盖的热循环仪内加热反应混合液到94℃，5分钟。

3. 以94℃30秒、42℃30秒、72℃1分钟的条件共循环25次，扩增VH基因。

4. 用Wizard PCR纯化试剂盒芝之PCR产物。

5. 用XhoI和NcoI消化PCR产物；但除了用XhoI替代  NcoI,还需在NEB2缓冲液中进行消化。

6. 制备VL基因文库载体；但需用XhoI和NcoI消化载体。

7. 连接已消化的PCR产物和已消化的载体，并电转化到大肠杆菌TG1中，构建轻链改组文库。