用流式测细胞周期的一点总结

【细胞种类】小牛肺动脉平滑肌细胞第5代；
【培养液】含15％FBS的MEM液；
【固定方法】70％酒精固定；
【染色方法】PI单染法；
【具体步骤】
1、接种： 以1undefined5/ml密度（活细胞）接种，加培养液；
2、同步化： 24h后加不含FBS的MEM进行同步化12－24h；
3、加因素： 弃MEM液换等量的培养液，加药物等因素培养到指定时间；
4、消化： 用不含EDTA的0.25％胰酶进行消化，离心（2000转5min）；
5、洗涤： 用PBS液洗一边，弃上液；
6、固定： 向10ml试管内加2.5ml盐水G溶液（配置方法见司徒镇强《细胞培养》）重新悬浮细胞，然后缓慢加入－20度预冷的95％酒精7.5ml，冰浴30min；（可以过夜，第二天染色）
7、PI单染法： 吹散细胞后用300目尼龙滤膜过滤，然后离心，去上液；加100ul 5mg/ml RNA酶溶液，37度保温30min，然后冰浴终止酶作用；加PI染液（100ug/ml）闭光染色30min；
8、FCM测细胞周期。

【注意点】
1、同步化是为了各单个细胞处于相对的同一周期内，即“饥饿疗法”，目前虽有争议，但这一步是不可或缺的。
2、对于PI单染还是双染好，目前也是意见不一，本实验采用单染法。
3、300目尼龙滤膜过滤是为了减少聚在一起的细胞团，防治堵塞流式仪。