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MHC-I单体的生物素化

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2503
      单体HLA-1类分子必须借助于其他分子的连接才能形成四聚体,一般借助生物素-亲和素将单体HLA-I类分子连接为四聚体,这种连接方式要求HLA-I分子重链C端或轻链上能够与生物素结合。此步骤是在BirA酶(生物素-蛋白连接酶)的作用下,将生物素结合到HLA-I类分子重链的BSP位点上。
 
      [试剂及材料]
      1. 100mM  生物素(Tris-base中)
      2. 100mM  ATP(PH7.0)
      3. 100mM  PMSF(异丙醇中)
      4. 1mg/ml  Leupeptin(白胃素) (水中)
      5. 1mM   Pepstatin (胃酶抑素)(甲醇中)
 
      [操作步骤]
 
      1. 将下述物质加入上一步的收集液中。
      ①生物素,终浓度为400uM
      ②ATP,终浓度为5mM
      ③PMSF,终浓度为200mM
      ④Leupeptin,终浓度为1ug/ml
      ⑤Pepstatin,终浓度为1uM
      ⑥15ul  BirA酶, 终浓度为0.1uM
 
      2. 室温下孵育过夜。
 
      3. 将上述生物素化反应液置低温离心机中,用最大速度离心以去除沉淀。
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