MHC-I单体的生物素化

互联网2010-12-02

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单体HLA-1类分子必须借助于其他分子的连接才能形成四聚体，一般借助生物素-亲和素将单体HLA-I类分子连接为四聚体，这种连接方式要求HLA-I分子重链C端或轻链上能够与生物素结合。此步骤是在BirA酶（生物素-蛋白连接酶）的作用下，将生物素结合到HLA-I类分子重链的BSP位点上。

[试剂及材料]

1. 100mM 生物素（Tris-base中）

2. 100mM ATP(PH7.0)

3. 100mM PMSF(异丙醇中)

4. 1mg/ml Leupeptin(白胃素) （水中）

5. 1mM Pepstatin （胃酶抑素）（甲醇中）

[操作步骤]

1. 将下述物质加入上一步的收集液中。

①生物素，终浓度为400uM

②ATP，终浓度为5mM

③PMSF，终浓度为200mM

④Leupeptin，终浓度为1ug/ml

⑤Pepstatin，终浓度为1uM

⑥15ul BirA酶, 终浓度为0.1uM

2. 室温下孵育过夜。

3. 将上述生物素化反应液置低温离心机中，用最大速度离心以去除沉淀。

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