MHC-I单体的折叠
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MHC-I
单体的折叠
此步骤是将HLA-I类分子的重链、轻链以及抗原肽通过折叠形成完整的HLA-I类分子单体。
【试剂及设备】
1、试剂及配制
（1）折叠缓冲液（PH8.3）
400mM L-Arginine(左旋精氨酸)
100mM Tris
2mM EDTA
（2）注射缓冲液（PH 4.2）
3M Guanidine HCl（盐酸胍）
10mM NaAcetate(乙酸钠)
10mM EDTA
（3）重链，轻链，抗原肽（流感病毒基质抗原肽MP58-66
（GILGFVFTL），人工合成9肽）
（4）还原型谷胱甘肽，氧化型谷胱甘肽，100mM PMSF（苯甲磺酰氟）
2、设备
磁力搅拌器与搅拌棒
10℃水浴箱
1L烧杯
5ml注射器
1000μl加样器及吸头
【操作步骤】
（1） 预先在1升的烧杯中准备1升折叠缓冲液，内放一个磁力搅拌棒，置10℃水浴冷却。
（2） 向冷却的折叠缓冲液中加还原型谷胱甘肽至终浓度为5mM；再加氧化型谷胱甘肽至终浓度为0.5mM；加PMSF至终浓度为0.2mM
（3） 按照终浓度分别为1μM,2μM,30mg/L，计算需加入的重链，轻链，肽的量。
（4） 分别将重链，轻链各加入5.0ml注射缓冲液，在室温下分别吸入两支5.0ml注射器。
（5） 依据肽的氨基酸序列不同，可将其稀释于500μl双蒸水或DMSO
（6） 将装有折叠缓冲液的烧杯置磁力搅拌器上，以高速进行磁力搅拌。
（7） 用吸管将抗原肽加入反应体系。
（8） 急速将重链（1μM）和轻链用26号针头注入反应体系，针头尽可能靠近磁力搅拌器。加入轻链后，折叠反应体系将会稍稍变得不透明。
（9） 将折叠反应体系置10℃过夜。
（10） 早晨：仅仅将重链（1μM）注入反应体系（方法如前，反应体系中已有重链2μM），并重置于10℃
（11） 晚上：仅仅将重链（终浓度为3μM）注入反应体系，并重置于10℃
（12） 10℃过夜。
