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浓缩MHC-I单体折叠反应物

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浓缩MHC-I单体折叠反应物
上述折叠的HLA-I/抗原肽复合物存在于1L的折叠缓冲液中,需要进行浓缩,可以采用超滤进行浓缩。
【试剂及设备】
试剂与材料:20mM Tris(PH8.0)
Biomax 30 membrane
设备: 超滤装置(Amicon 500ml Stir Cell)
带有压力调节器的氮气瓶
【操作步骤】
(1)按照操作程序连接好超滤装置,将500ml待浓缩的样品(折叠反应物)加入超滤装置中,将压力调节至60psi,进行常规超滤浓缩。
(2)重复一次,将另500ml折叠反应物进行超滤浓缩。
(3)最后将上述折叠反应物超滤浓缩到约7ml的体积。
(四)缓冲液平衡
上述步骤制备的单体HLA-I类分子需要进行缓冲液平衡,可以采用下述二种方法之一。
方法一:透析
【试剂及材料】
1. 材料
(1)透析袋(Spectrapor 7)和夹子
(2)1升的烧杯
(3)1 X PBS
(4)100mM PMSF
(5)7ml浓缩后的折叠复合物
2. 试剂:生物素化缓冲液:
100mM Tris(PH7.5)
200mM NaCl
5mM MgCl
【操作步骤】
(1)将1升生物素化缓冲液加入1升的烧杯中,并放一个磁力搅拌棒于其中。冷却至4℃。
(2)准备透析袋,10ml浓缩物用二倍容积的透析袋进行透析,以便在透析时体积扩大。
(3)用合适大小的夹子将透析袋的一端夹住,小心地将浓缩后的样品吸入透析袋,夹住另一端,并留出可供体积扩大的空间。
(4)将透析袋置于上述烧杯中,并将烧杯放在磁力搅拌器上,在4 ℃进行透析。
(5)以中/低速旋转2-3小时,或直到透析袋中的沉淀溶解。
(6)小心地吸出透析袋中的样品,并将其分装于离心管中(1.5ml/管)。
(7)在低温台式离心机中以最大速度离心,以除去沉淀。
方法二:用脱盐柱进行缓冲液交换
PD-10交换柱是为蛋白质溶液进行缓冲液交换而设计的,其中的微珠孔径(6000MW)比绝大部分蛋白质要小,但比缓冲液中其他分子要大。当蛋白质溶液流经该柱时,蛋白质分子很快通过,而其他分子被截留在柱子的微珠中。因此,流出的蛋白质是溶解在平衡柱子的缓冲液中,从而实现了蛋白质的缓冲液交换。
【试剂及材料】
1、 材料: PD-10 脱盐柱(Amersham Pharmacia,PD-10)
2、 试剂:生物素化缓冲液
100mM Tris(PH7.5)
200mM NaCl
5mM MgCl2
【操作步骤】
(1)按照操作程序将柱子准备好。
(2)用25ml生物素化缓冲液平衡柱子,该柱子的容量大约是5ml,加入5ml缓冲液,待其流出后,再加入5ml,共平衡5次。
(3)加入2.5ml样品。最初流出的2.5ml液体应弃去。
(4)当这2.5ml样品完全进入柱子后,在柱底部用15ml收集管开始收集流出的液体。
(5)加3.5ml上述缓冲液,让其完全流进柱子,收集样品。每个柱子收集3.5ml流出液,样品中的蛋白都会收集在流出中。
(6)为了柱子能够再次使用,先用10ml 去离子水洗柱子,然后用25ml 20%乙醇或PBS+0.1%叠氮钠冲洗。
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