选择WB（Western Blot）底物显色方法的关键

普健生物（武汉）科技有限公司2022-10-27

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Western Blot（WB）又称蛋白质免疫印迹法，是基于蛋白质SDS-PAGE电泳分离和特异性抗体识别蛋白的特性，通过显色技术检测目的蛋白的技术。该技术主要应用于以下场景：(1)检测目标蛋白；(2)定量或定性地确定细胞或组织中蛋白质的表达；(3)用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA和蛋白质-RNA相互作用的后续分析。实验步骤多，关键点多，耗时长，每一步都可能影响实验最终结果，小编今天主要为大家介绍WB底物显色方法的选择。

底物显色是WB实验的最后一步，也是实验成败关键的一步。显色标记方法包括生物素标记、地高辛标记、各种酶标记等，酶标的底物有丰富的选择，显色方法也多种多样。其中主流的显色方法为酶促反应，该方法相较生物素反应更快也更安全。

酶促反应根据不同底物显色方法又分为化学发光和底物显色。化学发光法灵敏度高，可达pg级；底物显色操作简单且成本低。目前最为人熟知的底物显色有HRP（辣根过氧化物酶，Horseradish Peroxidase）和AP（碱性磷酸酶，Alkaline Phosphatase）两种。

01 HRP

生色底物

HRP因比活高、分子量小、特异性强、稳定性好和底物范围广等优点成为最常见的酶促发光或显色的交联酶。HRP底物主要包括化学发光底物和生色底物。底物的选择需优先考虑灵敏度、背景及使用的方便性和稳定性，生色底物主要包括DAB、4-CN、CN/DAB、AEC和TMB等，其显色主要是在HRP和H₂O₂存在下失去电子并呈现颜色变化积累的WB检测结果。

底物	DAB	4-CN	AEC	TMB
稳定性	好	一般	需避光	好
灵敏度	高	低	高	高
背景	一般	低	高	高
成像难易	不能很好成像	易成像	——	易成像
颜色	褐色	蓝色—蓝紫	棕红色	蓝紫色
毒性	有毒	无	有毒	无

4种生色底物比较

上表对这4种生色底物从不同方面进行比较。

DAB作为最熟悉的底物，灵敏度高，特异性好，缺点就是需要现配现用，显色后光照数小时会褪色，不能永久保存，而且有毒。

4-CN反差大易于拍摄对比度大的照片，可与DAB配合使用。

TMB信噪比高，成分安全，特别合适于对灵敏度要求高的WB，但是也要避免由于灵敏度高而引起的高背景，因此可以相应的延长密封时间和洗涤次数。

AEC在各方面与DAB相似，但灵敏度较低。

化学发光底物

最常用的化学发光衬底是鲁米诺（Luminol）。化学发光法与生色反应不同，它只在酶和底物同时存在的情况下发光，因此特别适合在同一膜上对不同的靶蛋白进行多重检测。目前最高检测灵敏度已达到Femto水平，已成为最安全、最灵敏的WB检测方法。在许多研究者的心目中，ECL几乎已经成为化学发光的代名词，一般含有Luminol、H₂O₂和发光增强剂等物质。发光试剂中的Luminol被HRP和H₂O₂氧化产生荧光，荧光被发光增强剂增强。

化学发光常见的问题是抗体的浓度过高，所以抗体的量要比规定的稀释量加大，以保证底物不会因为HRP过量而过快用完，导致结果不稳定。

02 AP

作为一种经典且常用的显色交联酶，AP的底物明显更稳定，而且在封闭良好的情况下，其显色灵敏度也达低pg水平。

	BCIP	NBT	BCIP/NBT	BCIP/INT
作用	与O₂反应形成沉淀	氧化反应	在AP的催化下，BCIP会被水解而与NBT发生反应	氧化反应
灵敏度	100pg	100pg	30pg	一般
沉淀颜色	紫色	蓝紫色	蓝紫色	棕红色
用途	AP显色	AP或者葡糖氧化酶	WB、原位杂交和免疫组化	AP和免疫组化

四种常用AP显色方法的比较

上表列举了常用的AP显色方法比较，包括BCIP（5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐）、NBT（四唑硝基蓝）和INT（硝基四紫唑），以及它们之间的组合使用。其中，BCIP/NBT是碱性磷酸酶的最佳底物组合之一，具有灵敏度最高、显色锐利、成像性能好等特点，是最常用的底物组合。

各种制色方法都有其优缺点和适用范围，以上这些介绍让大家把各种产品的优缺点都看得淋漓尽致，希望这些内容能给大家带来帮助，早日成为WB高手。

当然也提醒大家，操作时注意戴手套，有些显色试剂是有毒的，避免与皮肤直接接触，使用后记得及时彻底冲洗。