做好抗体标记，这4种方法你都用对了吗？

随着蛋白组学的深入研究，抗体标记技术也被广泛用于医学病理学、免疫组织化学、分子生物学、生物制药等领域，但很多科研人员在选择多种标记的抗体时遇到困难，那么今天我们一起了解这四种常用的抗体标记方法，这些方法平时都用对了吗？

什么是抗体标记？

抗体标记是指将标记物（酶，荧光素，生物素等）共价连接到抗体上，与待检测物（如某些特定抗原）特异性反应形成多元复合物，并借助于仪器对试验结果直接镜检观察或进行自动化测定，以用于对抗原、抗体反应进行定性和定位研究或进行定性和定量测定。
 

荧光色素标记抗体

这种标记方法是将荧光素与相应的抗体(或抗原)结合，将荧光标记的抗体(或抗原)与标本中相应的抗原形成荧光标记的抗体-抗原复合物，用荧光显微镜观察。在显微镜若存在荧光则意味着存在抗原抗体复合物，因此可根据已知的抗体(或抗原)推断出另一种未知抗原(或抗体)的存在。

操作步骤

1.用于分离标记抗体和游离的荧光色素准备好凝胶滤柱。使用消除分离球形蛋白的极限 20 000 ～ 50 000 凝胶介质和细粒凝胶(直径约 50 um）。所需凝胶滤柱的尺寸可根据偶联反应的总体积进行× 20 来确定。按厂家说明准备滤柱，用 20 双柱床体积 PBS 注入滤柱，直到缓冲液水平刚刚降低到柱床顶部，关闭滤纸底部的阀门或使用塑料粘土(或 parafilm ）封闭底部，使滤柱不再流动。

2.用0.1mol/L 硼酸钠或碳酸钠的制备浓度至少为 2mg/ml 的抗体溶液（pH9.0）。含一级胺的外来分子应避免引入。

3.用无水DMSO 溶解(优级纯) FITC或TRITC至1mg/ml。每次标记反应时需即时配置。

4.每 1ml 蛋白溶液加50ul染液，每次都要5ul 慢慢加入，加入时应轻轻连续搅拌。

置4℃避光反应1h 。

5.加氯化铵至50mmol/L，室温孵育2h。加入0.1 %二甲苯氰和5％甘油。

6.通过凝胶过滤分离结合物与未结合的染料。小心地将偶联反应产物加在滤柱顶部，打开阀门使抗体溶液流过滤柱直至刚好进入柱床。再小心地将 PBS 加在滤柱顶部并与缓冲液供应装置连接。结合染料的抗体首先洗脱，通常可在室光下见到。

7.将洗脱液的结合物4℃贮存于避光容器，必要时加入 0.02％叠氮钠。

8.进行荧光素偶联反应时，应通过测量495nm和280nm 波长的吸光值计算荧光素和蛋白的比率，罗丹明的测量波长在 550nm 和 280nm 。荧光素的吸光值比例（ 496nm/280nm ）应在 0.3 ～ 1.0 之间，罗丹明的吸光值比率（ 550nm/280nm ）在 0.3 ～ 0.7 之间。低于上述比率将导致低信号，高比率则出现高背景。若比率太低，应使用低浓度抗体与高浓度染料重复结合；若比率太高，则可适当调整后重新标记，或通过 DEAE 离子交换层析柱进一步纯化抗体。用 10mmol/L 磷酸钾（ pH8.0 ）平衡并灌注滤柱，通过增加盐浓度进行梯度洗脱。测量每一组分的吸光值比率（ 495/280 或 550/280 ），选取适当组分合并。

 

生物素标记抗体

抗体标记中生物素的引入使整个过程灵敏度大大提高！这种方法可使抗体或其它蛋白质的ε-氨基与酰化的生物素共价结合，生物素化的分子可以通过酶标记的抗生物素蛋白或荧光染料-链霉抗生物素蛋白复合物来检测。小分子水溶性生物素对链霉亲和素的高亲和力是该方法的设计基础。

操作步骤

1.用无水 DMSO 配制 10mg/ml 生物素 N- 羟基琥珀酰亚胺酯溶液。

2.硼酸盐缓冲液（0.1mol/L, pH8.8 ）配制浓度至少为1 ～3mg/ml 如果在抗体储存过程中添加叠氮钠，则必须在硼酸盐缓冲液中充分透析去除叠氮钠。

3.按25～100μg/mg将生物素酯加入抗体，在室温下均匀混合孵化4h。在完成组合反应之前DMSO最终浓度不得低于5 %，否则生物素酯会沉淀。高浓度的生物素酯会导致体上结合多个生物素分子，因此所有抗体都可能被标记。较低的比例将使生物素化保持在最低限度（25μg生物素酯/mg摩尔比最初是抗体10:1）。

4.每250μg添加生物素酯20μl1mol/L氯化铵，室温孵化10min 。

5.使用抗体溶液PBS 或其他缓冲液透析，以去除未结合的生物素。由于生物素分子较大，透析比预期的要慢，或使用蛋白质A或蛋白G层析柱再次纯化抗体。

6.标记抗体按纯化抗体的储存方法保存。

 

放射性碘标记抗体

蛋白质的碘标记方法有很多种，比如我们常用的化学法或酶促法通过氧化对蛋白质分子进行碘化等。

操作步骤

1.在碘标记前，准备氯甘脲包试管（2支6mm碱性玻璃管或1.5ml锥形试管)。氯甘脲溶于浓度0.5μg/ml的氯仿中。然后将其分别加入试管管100μl和20μl。让氯仿在通风柜中挥发过夜。在干燥器中储存室温试管，可保存数年。包被有20μl氯甘脲试管碘化效率低。如果抗体在正常碘化反应中受损，可以使用。

2.准备分离标记抗体的凝胶层分析柱，体的凝胶层分析柱。排阻限制为20000～50000凝胶介质用于分离球形蛋白分子。选择中等粒度的凝胶微柱(直径约100μm）。按说明书准备装备1ml标记后，体积凝胶微柱的滤柱将被丢弃，因此应选择合适的滤柱。为了最大限度地减少碘化蛋白的非特异性组合，滤纸应至少先使用10倍体积的含0.02％叠氮钠的1％BSA/PBS然后再用10倍体积的PBS去除淋洗滤柱BSA。或者用含BSA使用前冲洗缓冲液膨胀凝胶颗粒BSA。让滤柱内的缓冲液流出，直到刚好低于柱床顶部，关闭凝胶柱底部的阀门，或用塑料粘土堵塞胶柱末端。

3.碘化反应前应立即准备终止管，用于终止氧化反应，保留未参与结合反应的剩余碘。1.5ml加入锥形试管50μl氯甘脲终止缓冲液

4.室温下，在通风柜内加入氯甘脲袋50μl抗体0.5mol/L磷酸钠缓冲液（pH7.5）配制，浓度为0.2～1mg/ml。

5.添加抗体氯甘脲试管500μCiNa，把吸液头扔进去放弃125I容器中的材料2min，时间可以稍微延长，但可能会增加抗体的氧化损伤。

6.用巴斯德移液管移动试管中的液体50μl轻轻混合氯甘脲终止缓冲液的试管。将巴斯德移液管和氯甘脲包放入放射性废物容器中。

7.小心将终止管中的反应混合物添加到滤柱中，并将移液管丢入放射性废物容器中。

8.放开滤柱阀门，开始收集洗脱液1.5ml锥形试管。碘标记蛋白流入凝胶微珠后，小心添加到滤柱中0.3ml含0.02％叠氮钠PBS。在第一管中继续收集洗脱液。当缓冲液到达凝胶微珠顶部时，用第二个锥形试管替换，然后加入滤柱0.3ml含0.02％叠氮钠的PBS，再收集洗脱液。继续重复上述洗脱步骤。微型检测仪用于监测各种管道125I标记抗体和游离标记物的峰值。抗体应出现在第一位2～4洗脱成分明显早于蓝色二甲苯蓝氰醇，后者与游离标记物一起洗脱。

9.合并含碘化抗体的洗脱组分。将未参与反应的标记物和整个过滤柱与放射性废物容器一起丢失。

10.可储存标记抗体1％PBS/BSA放入洗脱缓冲液中4℃保存。抗体虽然稳定，但放射性碘不稳定。因此，应标记抗体6周内使用。

 

生物合成法标记单克隆抗体

操作步骤

1.杂交瘤细胞在标记时必须生长旺盛，快速增殖。离心（3000 转/10min）收集大约2×106个细胞。

2.用37℃不含蛋氨酸的培养基重悬细胞，洗一次，然后离心300g，10min。

3.不含蛋氨酸的培养基重悬细胞至约106/ml。加入[35S]蛋氨酸(每次标记100μCi）可获得的放射性强度约为105～106cpm的抗体。

4.于CO2培养箱中37℃孵育过夜

5.悬液细胞1000g离心10min，获得密集的细胞沉淀。放弃上清液。1/20体积的1mol/LTris(pH8.0)和叠氮钠至0.02％。
 

关于普健

普健生物（AtaGenix）于2012年在武汉成立，作为武汉国家生物产业基地公共服务平台—光谷抗体发现与筛选公共服务平台。普健生物（AtaGenix）专注于重组蛋白、抗体、诊断原料、抗体药物发现等自主技术平台的建设和下游生物医药产品的战略合作。经过10年的发展，普健生物已成为一家立足武汉，业务覆盖全国、辐射全球的高新技术服务企业。目前公司拥有4200平米自建实验室（包含800平高标准BSL-2级细胞房），拥有齐全蛋白抗体开发设备500余套，包括高通量蛋白纯化仪、Agilent 流式细胞分析仪，全自动HPLC分析仪，openSPR蛋白、抗体亲和力测定仪，Olympus荧光显微镜， BTX电融合仪，undefined7L微生物发酵罐，中试型高压均质机，全自动管式化学发光仪，以及配套的高速离心机，细胞计数仪及大容量细胞培养摇床。公司先后获得荣誉：3551人才计划、高新技术企业、技术先进型服务企业、光谷瞪羚企业