RT-PCR --- one-step
互联网
1058
This protocol uses C. therm. Polymerase One-Step RT-PCR system from Roche.
1. Setup master mix 1:
<center> <table> <tbody> <tr> <td> <font><font><font>25 mM dNTP</font> </font></font></td> <td> <font><font><font>0.8 <font>m</font> l</font> </font></font></td> </tr> <tr> <td> <font><font><font>DMSO</font> </font></font></td> <td> <font><font><font>2.5 <font>m</font> l</font> </font></font></td> </tr> <tr> <td> <font><font><font>100 mM DTT</font> </font></font></td> <td> <font><font><font>2.5 <font>m</font> l</font> </font></font></td> </tr> <tr> <td> <font><font><font>RNase Inhibitor (40 U/<font>m</font> l)</font> </font></font></td> <td> <font><font><font>0.5 <font>m</font> l</font> </font></font></td> </tr> <tr> <td> <font><font><font>forward primer (10-20 <font>m</font> M)</font> </font></font></td> <td> <font><font><font>1 <font>m</font> l</font> </font></font></td> </tr> <tr> <td> <font><font><font>reverse primer (10-20 <font>m</font> M)</font> </font></font></td> <td> <font><font><font>1 <font>m</font> l</font> </font></font></td> </tr> <tr> <td> <font><font><font>template RNA (50 pg-1 <font>m</font> g)</font> </font></font></td> <td> <font><font><font>1 <font>m</font> l</font> </font></font></td> </tr> <tr> <td> <font><font><font>nucelase-free ddH<sub><small>2</small> </sub> O</font> </font></font></td> <td> <font><font><font>15.7 <font>m</font> l</font> </font></font></td> </tr> </tbody> </table> </center>
2. Setup master mix 2:
<center> <table> <tbody> <tr> <td> <font><font><font><font>5X RT-PCR buffer</font> </font></font></font></td> <td> <font><font><font><font>10 <font>m</font> l</font> </font></font></font></td> </tr> <tr> <td> <font><font><font><font><em>C. therm.</em> polymerase mixture</font> </font></font></font></td> <td> <font><font><font><font>2 <font>m</font> l</font> </font></font></font></td> </tr> <tr> <td> <font><font><font><font>nucelase-free ddH<sub><small>2</small> </sub> O</font> </font></font></font></td> <td> <font><font><font><font>13 <font>m</font> l</font> </font></font></font></td> </tr> </tbody> </table> </center>
3. Mix 25 m l master mix 1 and 25 m l master mix 2.
4. Overlay with mineral oil if required.
5. Program the thermocycler such that the first cycle is for RT reaction at 60-72 ℃ for 30 minutes.
6. Follow by PCR reaction cycles.
7. Analyze the samples on a 1-2% agarose gel.
<center> <p> </p> </center>上一篇：Detecting DNA Contamination in RT-PC 下一篇：Gene-specific RT-PCR
