RAPD操作要点

一、 材料
　　不同来源的DNA(50ng/ul)。
　　二、设备
　　PCR仪，PCR管或硅化的0.5ml eppendorf管，电泳装置。
　　三、试剂
　　1、随机引物(10mer) (5umol/L)：购买成品。
　　2、Taq酶：购买成品。
　　3、10xPCR 缓冲液：配方见第八章。
　　4、MgCl2 ：25mmol/L。
　　5、dNTP：每种2.5mmol/L。
　　四、操作步骤：
　　1. 在25ul反应体系中,加入
　　　　模板DNA 1ul (50ng)
　　　　随机引物 1ul (约5pmol)
　　　　10xPCR Buffer 2.5ul
　　　　MgCl2 2ul
　　　　dNTP 2ul
　　　　Taq酶 1单位（U）
　　　　加ddH2O 至 25ul
　　混匀稍离心, 加一滴矿物油。
　　2. 在加热至90℃以上的PCR仪中预变性94℃ 2分钟, 然后循环: 94℃ 1分钟， 36℃ 1分钟， 72℃ 1分钟，共40轮循环。
　　3. 循环结束后, 72℃ 10分钟，4℃保存。
　　4. 取PCR产物15ul加3ul上样缓冲液(6x)于2% 琼脂糖胶上电泳, 稳压50-100Ｖ（电压低带型整齐， 分辨率高）。
　　5. 电泳结束，观察、拍照。
　　[注意] 1、电泳时一般RAPD带有5-15条, 大小0.1-2.0kb。
　　　　　　2、 特异性的DNA带可以克隆作为一个新的分子标记应用。