真菌原生质体制备技术

1． 灭菌物品：

（1） 大滤纸:

（2） 灭菌针筒（含脱脂棉和玻璃钎维）

（3） 脱脂棉

（4） 离心管

（5） 无菌ddH2O

（6） 0.6M MgSO4

（7） 培养基：

A. 等渗培养基（RCM）：麦芽汁 1%，酵母膏 1%，蛋白胨 0.4%，葡萄糖 0.4%，pH自然，用0.6M蔗糖配制。

B. 破膜培养基：麦芽汁 1%，酵母膏 1%，蛋白胨 0.4%，葡萄糖 0.4%，pH自然，用水配制。也可以采用含有0.6M蔗糖的PDA作为等渗培养基，破膜培养基不加0.6M蔗糖即可。

（8） 溶壁酶酶液：1.5%，用0.6MMgSO4配制，过滤除菌；

（9） 培养皿：根据样品个数

2． 制备方法：

（1） 称取离心管重量并记录；

（2） 用接种针挑出菌丝，并用灭菌双蒸水冲洗一次，然后用无菌的0.6M MgSO4冲洗两次，用灭菌的滤纸吸干，放入已知重量的离心管，称重并记录；

（3） 计算得到菌丝重量，按0.2（g）：1(mL)加入灭菌酶液，震荡均匀；

（4） 28℃，3~4小时，摇床震荡（轻微），酶解，同时每30min镜检观察原生质体数量；

（5） 灭菌注射器（含脱脂棉和玻璃钎维）过滤；

（6） 离心：2500rpm,2min

（7） 用0.6M MgSO4洗涤沉淀3次；

（8） 用用0.6M MgSO4定容至最初的加酶量；

（9） 镜检计数；记录；

（10） 涂板后再生培养，第7天后每隔1天计数一次。