植物原生质体的制备

最新修订时间：2022-02-10

原理

去掉植物细胞壁的方法可以是机械的人工操作，也可以利用酶解法。较早利用机械法制备原生质体的首推Klercker（1892），直到1960 年英国科学家Cocking 才第一次用酶法大量制备原生质体。本实验以植物的叶肉组织为材料，利用纤维素酶和果胶酶来消化细胞壁，分离细胞。

材料与仪器

油菜或菠菜或烟草
氯化钙蒸馏水 2蔗糖酶解液
显微镜离心机离心管剪刀镊子吸管培养皿载玻片盖玻片

步骤

1、取材根据实验目的和条件选取不同的材料

2、分离原生质体

（1）撕叶下表皮

（2）酶解将撕去下表皮的叶片剪成小块，放在盛有5mL 酶液的小培养皿中，让去除下表皮的一面接触酶液，辅满一层，在25——28℃下酶解60——90 分钟

3、收集纯化

（1）用吸管将酶解液吸至5mL 离心管中，以600rpm 离心5 分钟以上，使原生质体沉降

（2）将上清（酶解液）回收，剩下原生质体及残渣于管底

（3）加氯化钙液约2mL，轻轻吹打均匀

（4）用注射器向离心管底部缓缓注入蔗糖约2—3mL，出现下部蔗糖液，上部原生质体悬浮液

（5）以600rpm 离心10 分钟，在两液相之间出现一条绿色带，便是纯净的原生质体

4、观察或培养

取少许原生质体于载片上，盖片观察其形态，或者将原生质体接种在培养基上进行培养，再生植株。

注意事项

要培养悬浮细胞系需较长时间。因此,应着重改善培养条件,主要包括选用合适的培养基包括培养基种类、添加物、激素种类及水平等及培养方式根据培养物状态适时改换适宜培养基选择合适的外植体及诱导时期。

常见问题

原生质体是裸露的、具有生命活性的细胞,体内包裹着细胞核、细胞器、细胞质等, 因此原生质体具有再生细胞壁、进行连续分裂并生成完整植株的能力 , 即具有细胞全能性。原生质体能摄人如 DNA、质粒、病毒、细菌、细胞器等外源物质 , 是植物细胞工程进行遗传操作、基因转移的良好材料。

来源于《植物原生质体的制备与活力检测研究进展》生物技术通报。

来源：丁香实验