ELISA protocol

ELISA protocol：
1.取5－10ul BMMY表达上清用0.05M NaHCO3稀释到100ul铺ELISA板，37度或室温振荡大于1小时。注意一定要做一个GS115空菌株表达上清作为阴性对照，最好还找一个带有histag的蛋白作为阳性对照。
2.TPBS洗板3次，方法：倒掉铺板液，倒置于毛巾上轻轻拍打几次，加TPBS至满，重复。
3.加封闭液（TPBS加1％脱脂奶粉）350ml/孔，室温下放置40分钟－1小时，TPBS洗3次。
4.加封闭液稀释的histag一抗100ul/孔，ELISA板于室温振荡0.5－1小时，TPBS洗3次。很多公司都有histag的单抗，个人觉得Qiagen和Pharmacia单抗较好，Invitrogen和Labvision的一般般，一般1：1000－5000稀释，不同公司的抗体效价不同。
5.加封闭液稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗100ul/孔，ELISA板于室温振荡0.5－1小时，TPBS洗3次。二抗很多公司有，国产的华美都可以，1：500－1000。如果是HRP标记的histag抗体，不加二抗直接显色。
6.加入OPD显色液100ul/孔，避光反应约10－30分钟。显色液配方：1mg/ml OPD于0.1M 柠檬酸钠，PH5.5，0.1%H2O2，－20度避光保存。也可以用DAB显色。
7.1M H2SO4 100ul/孔终止反应，酶标仪测OD490nm。

ELISA相关试剂设备

• 洗板机
• 化学发光检测仪
• 酶标仪
• ELISA检测试剂盒
• ELISPOT检测
• ELISA试剂盒
• 抗体
• 酶标板