细胞内钙测定

式中Kd为 Fura-2与Ca 结合反应的介离常数，37℃ 时其值为224nmol/L,Fmax是细胞内Fura-2全部为Ca 饱和时的荧光比值（采用Ca 载体），Fmin为Fura-2完全未结合Ca 时的荧光比值。通过向介质中加入过量的EGTA将细胞内外的游离Ca 螯合，此时测得的最小荧光值。F为实验中以340nm和380nm波长激发，500nm波长发射测定负载Fura-2/AM细胞的荧光比值。

 

 

静息态时[Ca ]i<0.1umol/L。[Ca ]₀ 浓度为1～１.5mmol/L,细胞内外[Ca ]相差10⁴ 。细胞膜内外的[Ca ]差是细胞外的Ca 进入细胞内的推动力。

 

( 组织细胞以12.5%胰蛋白酶消化20－30 min)

 

37℃ 温育10min, 加入Fura-2/AM（终浓度为2-5ug/ml），37℃ 恒温震荡45 min,负载后细胞以含0.2%牛血清白蛋白的Hank’s液洗2次，用Hank’s液调细胞数为1×10⁶ ，测定前37℃ 复温5-10 min。

 

37℃ 温育10 min，测荧光（负载Fura-2/AM细胞的荧光比值F）

 

↓

 

加Triton X 100 100 μl

 

↓

 

37℃ 温育5 min

 

↓

 

340nm测荧光（最大值Fmax）

 

↓

 

20℃ 水浴5 min

 

↓

 

冰浴 2 min

 

↓

 

加EGTA 80μl（40mM ）

 

↓

 

水浴5 min → 冰浴 5 min

 

↓

 

380 nm 测定荧光（最小值Fmin）