电转感受态细胞的制备

试剂准备：

LB培养基: 500mL
双蒸水：600mL 高压灭菌 预冷
10%甘油：1000mL 预冷
250ml离心杯：高压灭菌 预冷

50mL离心管数个，250mL摇瓶4个，1.5mL EP管 高压灭菌

制备步骤：

1、接种原代菌（DH5α或DH10B），次日挑取单菌落，放入1mL LB培养基中，37℃，300rpm，6 hr；
3、然后转接到含500ml LB液体培养基的2L摇瓶中（按1:500的量转接），300rpm，3~4 hr，OD550为0.3时每隔20 min测一次，至OD550=0.8；
4、立刻置冰水浴中骤冷：可以选择在一个大的装有冰水混合物的容器，放在摇床上快速旋转摇动，尽快使培养物温度降下来；
5、随后在250ml预冷的离心杯中离心，4℃，4000 rpm，30 min；
6、弃上清后，用预冷的灭菌双蒸水洗：先加少量水悬浮菌体（具体办法：在一个大的装有冰水混合物的容器里旋转摇动离心杯使菌体悬浮），菌体悬浮后再把水加至500mL，3900 rpm，20 min，弃上清；
7、再用10%的预冷甘油500mL洗1次，3900 rpm，20 min；将两个离心管中的细菌混合，10%的预冷甘油100mL洗1次，3900 rpm，20 min

8、最后一次倒尽甘油后（尽量去干净），加1mL甘油悬浮细胞，每20μl分装到1.5 mL EP管（EP管要-80度预冷），用-80℃的乙醇迅速冰冻， -80℃保存备用。

(责任编辑：大汉昆仑王)