快速分离单个核细胞方法总结

三一造血技术有限公司2022-05-11

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【实验操作步骤】
1 使用移液管（枪）吸取15ml淋巴细胞分离液注到50ml分离管下室（15ml分离管吸取4ml）；
注意：请用移液管直接将淋巴细胞分离液通过隔板小孔注到分离管下室，勿将分离液置于分离管上室，否则分离液难以流至下室，影响后续分离操作。
2在50ml分离管中加入2-30ml稀释血液样品（15ml分离管倒入0.5-8ml）；
注意：
1）请勿将稀释血液样品注入到隔板下室；
2）请将稀释血液从隔板上方缓缓加入，所加入的位置勿距离隔板太远，否则容易在管壁上残留血液样本。
3在1200g条件下离心10分钟；
注意：可延长离心的时间，去除更多的粒细胞，从而获得纯度更高的PBMC；
4离心后，管内样品从上往下分层如下：血浆-白膜层-分离液-隔层-分离液-红细胞沉淀；
5直接将隔板上层液体快速倾倒入另一无菌离心管中(有少许红细胞贴于隔层上方为正常现象，因其离心后贴壁不会随上层液体倾倒出来)；
注意：倾倒隔板上层液体时需迅速，且一次性完成，勿反复倾倒。通常白膜层距离下方隔板尚有一段距离，因此倾倒时也不必将全部上层液体全部倒尽。
6加入PBS至45mL（15mL分离管则至12mL）, 用移液管重悬清洗细胞，室温300g离心10分钟；
注意：此步骤可去除大部分PBMC中的血小板。
7重复第6步一到两次，获得的单个核细胞可以冻存或进行下游分析和培养。
注意：重复第6步的洗涤可去除更多的血小板，但过多次的洗涤会造成PBMC的损失。