骨髓单个核细胞分离方法及注意事项

骨髓单个核细胞（Bone Marrow Mononuclear Cells，BMMNCs）是一群混合细胞，其中绝大多数是早幼粒细胞、早幼红细胞、成熟B细胞、T细胞和单核细胞等，还含有少量的干细胞，包括间充质干细胞、造血干细胞和内皮祖细胞等，它们密度相近，因此可通过密度梯度离心法从骨髓液中分离出来。

1    原理

单个核细胞的体积、形态和比重与其它细胞不同，在沉降过程中不同比重的细胞会处于不同的分布位置。因此，可利用各种血细胞和单个核细胞比重之间的差异将各种血细胞与单个核细胞分离开来。

2    方法

1）  无菌条件下抽取骨髓于含抗凝剂的采血管内，将骨髓与生理盐水或PBS溶液按等比例混匀，备用。

2）  按照稀释骨髓：细胞分离液比例为3:2的比例，缓慢将稀释骨髓液加入到细胞分离液上层，需保持液面分界清晰。

3）  800g，室温，离心 20min-30min（注：设置较慢的加速度和减速度，如果有十档，设为第三档）。

4）  小心吸取骨髓单个核细胞层（即白膜层）并转移至15mL离心管中。离心结束后，管内液面从上至下依次为无细胞骨髓液层、骨髓单个核细胞层、分离液层和红细胞层（见图1）。
5）  向离心管中加入10mL 的生理盐水或PBS重悬细胞，250g，室温离心 10min ，弃上清。重复该步骤 1~2 次，即可用于后续试验。

3    注意事项

1）  不同种属动物单个核细胞的比重有一定差异，请选择合适的分离液进行骨髓单个核细胞的分离。

2）  骨髓液新鲜程度是影响分离效果的关键因素，请尽量使用采集后24小时内的骨髓液进行单个核细胞分离。

3）  为保证细胞的活力，整个操作过程请轻柔，避免对细胞造成机械性的损伤。

4）  为保持细胞状态良好，请尽量缩短整个试验的周期。

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