技术分享 ▏个性化修饰性抗体技术解读之泛素化抗体
普健生物（武汉）科技有限公司
泛素（ubiquitin，Ub）是一种小分子多肽，由76个氨基酸组成并广泛分布于真核细胞中。其主要功能是非底物特异性的标记需要降解的蛋白质，主要存在形式包括：游离的泛素、多泛素链、泛素化蛋白；不同形式存在的泛素含量反映了细胞的不同生理状态。
不同类型的泛素化
泛素化是指泛素分子在一系列特殊酶（如泛素激活酶、结合酶、连结酶、降解酶等）的作用下，将细胞内的蛋白质进行分类，筛选出靶蛋白分子并对其进行特异性修饰的过程。由于泛素化的多样性与多价性，泛素化广泛参与包括细胞增殖、分化、凋亡、自噬、DNA损伤修复、免疫应答等各种生理过程，是近年来生物化学研究的一个重大成果，已成为新药开发的主要方向之一。
泛素化修饰涉及泛素激活酶E1、泛素结合酶E2和泛素连接酶E3的一系列反应：
在ATP供能的情况下E1粘附在泛素分子尾部活化泛素分子生成Ub-E1复合体，E1将激活的泛素分子转移到E2酶上形成Ub-E2复合体。随后，E2酶和一些种类不同的E3酶共同识别靶蛋白，对其进行泛素化修饰。根据E3与靶蛋白的相对比例可以将靶蛋白单泛素化修饰和多聚泛素化修饰。
泛素化过程(Stone, Sophia L., 2019)
E1：泛素激活酶E1；E2：泛素偶联酶E2；E3：泛素连接酶E3；
Target：靶蛋白；Ubiquitin：泛素；DUBs：去泛素化酶。
P.S.单个泛素分子以其C-末端赖氨酸与靶蛋白的一个Lys侧链相连叫做单泛素化，与多个赖氨酸残基相连叫做多泛素化。如果靶蛋白的单个Lys残基被多个泛素分子标记则称为多聚泛素化。
简而言之，也就是在E1、E2、E3三类酶的顺序催化下，泛素被以特异性的方式连接到靶标蛋白质或靶标蛋白质上已连接的泛素链上，其中E3泛素化连接酶决定靶蛋白的特异性识别。蛋白质泛素化的结果是使得被标记的蛋白质被蛋白酶分解为较小的多肽、氨基酸以及可以重复使用的泛素。
自泛素-蛋白酶体系统在20世纪80年代初被发现以来，与其相关的研究成果层出不穷。泛素对细胞的生命活动不可或缺，但由于泛素化的复杂性，人们目前的认知也只是冰山一角，很多问题仍有待研究。泛素化抗体适用于检测不同形式的泛素，以帮助科研人员了解细胞在生命活动中差异显著的蛋白质的性质，研究这些变化的规律，可帮助科研人员准确定位泛素化靶点和靶向相关疾病的治疗。例如，诊断阿尔茨海默病（AD）的神经原纤维缠结和成对螺旋丝，帕金森病中的路易小体，以及尼曼-匹克病中的匹克小体都是高度泛素化的，可以很容易地用泛素抗体检测到。
如何检测蛋白是否泛素化
通过免疫共沉淀方法分离特定蛋白质及其结合蛋白(包括被泛素化修饰的蛋白)。分离出的蛋白经SDS电泳后用泛素抗体进行western blot分析，可以鉴定具体哪个蛋白发生了泛素化修饰以初步判断某蛋白具有泛素化功能。
将研究蛋白（被泛素化的蛋白）通过蛋白提取试剂盒提取内源性蛋白或通过基因工程技术重组表达后提纯。用k63或k48连接的泛素链肽段系列酶E1、E2、E3在适当条件下体外孵育，然后用western blot和泛素化抗体检测。该方法可以明确所研究蛋白的哪个赖氨酸残基容易发生泛素化。
将待研究蛋白A（被泛素化的蛋白）与UBE1，Ubc13和UBE2V2 complex，Tag-ubiquitin以及待研究的蛋白B（具有泛素连接酶E3活性）在体外反应缓冲液中共同进行孵育。将孵育后的产物进行IP和WB分析。该方法可以明确引起B蛋白是引起A蛋白发生泛素化修饰的且具有E3连接酶活性。
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