淋巴细胞杂交瘤单克隆抗体技术
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原理
1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。
制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤。
材料与仪器
小鼠 骨髓瘤细胞
NCS
CO2孵箱 培养板
NCS
CO2孵箱 培养板
步骤
一、细胞融合前准备
②用上述0.5 ％琼脂液（含有饲养细胞）15 ml倾注于直径为9 cm的平皿中，在室温中待凝固后作为基底层备用。
③按100 /ml，500 /ml或5000 /ml等浓度配制需克隆的细胞悬液。
④1 ml 0.5 ％琼脂液（42 ℃预热）在室温中分别与1 ml不同浓度的细胞悬液相混合。
⑤混匀后立即倾注于琼脂基底层上，在室温中10 分钟，使其凝固，孵育于37 ℃，5 ％CO2孵箱中。
⑥4～5天后即可见针尖大小白色克隆，7～10天后，直接移种至含饲养细胞的24孔板中进行培养。
⑦检测抗体，扩大培养，必要时再克隆化。
1. 免疫方案
选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。
（1）颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。下面以细胞性抗原为例的免疫方案
初次免疫 1×107/0.5 ml ip （腹腔内注射）
↓ 2～3周后
第二次免疫 1×107/0.5 ml ip
↓ 3周后
加强免疫（融合前三天）1×107/0.5 ml ip或iv（静脉内注射）
↓
取脾融合
（2）可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂。要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。
初次免疫 Ag 1～50 μg 加福氏完全佐剂皮下多点注射（一般0.8～1 ml 0.2 ml/点）
↓3周后
第二次免疫 剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（ip剂量不宜超过0.5 ml）
↓3周后
第三次免疫 剂量同上，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价，检测免疫效果）
↓2～3周后
加强免疫，剂量50～500 μg为宜，ip或iv
↓3天后
取脾融合
目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如
①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。
②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。
③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，促进免疫细胞对抗原反应性。
①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。
②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。
③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，促进免疫细胞对抗原反应性。
2. 饲养细胞
在制备单克隆抗体过程中，许多环节需要加饲养细胞，如：在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞（较为常用）、小鼠脾脏细胞或小鼠胸腺细胞，也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞，使用比较方便，照射后可放入液氮罐长期保存，随用随复苏。
小鼠腹腔巨噬细胞的制备
小鼠采用与免疫小鼠相同的品系，常用BaLb/c小鼠6～10 周龄
↓
拉颈处死，浸泡于75 ％酒精，消毒3～5 分钟
↓
用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜
↓
用无菌注射器注入6～8 ml培养液
↓
反复冲洗，吸出冲洗液
↓
放入10 ml离心管，1200 转/分离心5～6 分钟
↓
用20 ％小牛血清（NCS）或胎牛血清（FCS）的培养液混悬，调整细胞数1×105 /ml
↓
加入96孔板，100 μl/孔
↓
放入37 ℃，CO2孵箱培养
一般饲养细胞在融合前一天制备，一只小鼠可获得5～8×106 腹腔巨噬细胞，若用小鼠胸腺细胞作为饲养细胞时，细胞浓度为5×106 /ml，小鼠脾细胞为1×106 /ml，小鼠的成纤维细胞（3T3）1×105 /ml，均为100 μl/孔。
3. 骨髓瘤细胞
骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。
常用骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2/0、X63 Ag8.653等。
骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI1640，DMEM培养基。小牛血清的浓度一般在10～20 ％，细胞的最大密度不得超106 /ml，一般扩大培养以1∶10稀释传代，每3～5 天传代一次。细胞的倍增时间为16～20 小时，上述三株骨髓瘤细胞系均为悬浮或轻微贴壁生长，只用弯头滴管轻轻吹打即可悬起细胞。
一般在准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对HAT的敏感性，每3～6月应用8～AG（8氮杂鸟嘌呤）筛选一次，以防止细胞的突变。
保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95 ％，也是决定细胞融合的关键。
4. 免疫脾细胞
免疫脾细胞指的是处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞和浆母细胞。一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，由于此时B淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高。
脾细胞悬液的制备
在无菌条件下取出脾脏，用不完全的培养液洗一次，置平皿中不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数。一般免疫后脾脏体积约是正常鼠脾脏体积的2倍，细胞数为2×108左右。
在无菌条件下取出脾脏，用不完全的培养液洗一次，置平皿中不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数。一般免疫后脾脏体积约是正常鼠脾脏体积的2倍，细胞数为2×108左右。
二、细胞融合，选择杂交瘤
1. 细胞融合流程
（1）取对数生长的骨髓瘤细胞SP2/0，1000 rpm离心5 分钟，弃上清，用不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤2 次。
（2）同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤2 次。
（3）将骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起，在50 ml塑料离心管内不完全培养液洗1 次，1200 rpm，8分钟。
（4）弃上清，用滴管吸净残留液体，以免影响PEG的浓度。
（5）轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动。
（6）在室温下融合
①30 秒内加入预热的1 ml45 ％PEG（Merek，分子量4000）含5 ％DMSO，边加边搅拌。
②作用90 秒钟，若冬天室温较低时可延长至120 秒钟。
③加预热的不完全培养液，终止PEG作用，每隔2 分钟分别加入1 ml，2 ml，3 ml，4 ml，5 ml和10 ml。
（7）离心，800 rpm，6 分钟。
（8）弃上清，先用6 ml左右20 ％小牛血清RPMI1640轻轻混悬，切记不能用力吹打，以免使融合在一起的细胞散开。
（9）根据所用96孔培养板的数量，补加完全培养液，10 ml一块96孔板。
（10）将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板，100 μl/孔，37 ℃、5 ％CO2孵箱培养。
一般一块96孔板含有1×107脾细胞。
2. HAT选择杂交瘤
一般在融合24 小时后，加HAT选择培养液。HT和HAT均有商品化试剂50×贮存，用时1 ml加入50 ml20 ％小牛血清完全培养液中。
因为在培养板内已加入饲养细胞、融合后的细胞，200 μl/孔。所以在加选择培养液时应加3倍量的HAT。我们认为，融合后最初补加的量可用全量的2/3进行选择，可得到满意的筛选结果。
50×HAT
H: 5×10-3M
A: 2×10-5M
T: 8×10-4M
一般选择HAT选择培养液维持培养两周后，改用HT培养液，再维持培养两周，改用一般培养液。
三、抗体的检测
筛选杂交瘤细胞通过选择性培养而获得杂交细胞系中，仅少数能分泌针对免疫原的特异性抗体。一般在杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。
检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同，选择不同的筛选方法，一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。
常用的方法有
1. ELISA用于可溶性抗原（蛋白质）、细胞和病毒等McAb的检测。
2. RIA用于可溶性抗原、细胞McAb的检测。
3. FACS（荧光激活细胞分类仪）用于检查细胞表面抗原的McAb检测。
4. IFA用于细胞和病毒McAb的检测。
上述方法均为一般实验室的常规方法，故在此不介绍具体的实验过程。
可靠的筛选方法必须在融合前建立，避免由于方法不当贻误整个筛选时机。
四、杂交瘤的克隆化和冻存
克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。经过HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。在实际工作中，可能会有数个甚至更多的克隆，可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞；所需要的抗体（特异性抗体）分泌细胞和其它无关抗体分泌细胞。要想将这些细胞彼此分开，就需要克隆化。克隆化的原则是，对于检测抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制，因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快，二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆，以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失，从而丧失产生抗体的能力。
1. 克隆化方案
用克隆化的方法很多，而最常用就是有限稀释和软琼脂平板法。
（1）有限稀释法的程序
①制备饲养细胞悬液（同融合前准备）
②阳性孔细胞的计数，并调细胞数在1～5×103 /ml
③取130 个细胞放入6.5 ml含饲养细胞完全培养液，即20 个细胞/ml，100 μl/孔加A、B、C三排为每孔2 个细胞。余下2.9 ml细胞悬液补加2.9 ml含饲养细胞的完全培养液，细胞数为10 个/ml，100 μl/孔加D、E、F三排，为每孔1 个细胞。余下2.2 ml细胞悬液补加2.2 ml含饲养细胞的完全培养液，细胞数5 个/ml，100 μl/孔，加G、H两排，为每孔0.5 个细胞。
④培养4～5天后，在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆，补加完全培养液200 μl/孔。
⑤第8～9天时，肉眼可见细胞克隆，及时进行抗体检测。
注：初次克隆化的杂交瘤细胞需要在完全培养液中加HT。
（2）软琼脂法
①软琼脂的配制
含20 ％FCS（小牛血清）的2倍浓缩的RPMI1640
1 ％琼脂水溶液：高压灭菌，42 ℃预热。
0.5 ％琼脂：由1份1 ％琼脂加1份含20 ％小牛血清的2倍浓缩的RPMI1640配制而成。置42 ℃保温。
②用上述0.5 ％琼脂液（含有饲养细胞）15 ml倾注于直径为9 cm的平皿中，在室温中待凝固后作为基底层备用。
③按100 /ml，500 /ml或5000 /ml等浓度配制需克隆的细胞悬液。
④1 ml 0.5 ％琼脂液（42 ℃预热）在室温中分别与1 ml不同浓度的细胞悬液相混合。
⑤混匀后立即倾注于琼脂基底层上，在室温中10 分钟，使其凝固，孵育于37 ℃，5 ％CO2孵箱中。
⑥4～5天后即可见针尖大小白色克隆，7～10天后，直接移种至含饲养细胞的24孔板中进行培养。
⑦检测抗体，扩大培养，必要时再克隆化。
2. 杂交瘤细胞的冻存
及时冻存原始孔的杂交瘤细胞、每次克隆化得到的亚克隆细胞是十分重要的。因为在没有建立一个稳定分泌抗体的细胞系的时候，细胞的培养过程中随时可能发生细胞的污染、分泌抗体能力的丧失等等。如果没有原始细胞的冻存，则因为上述的意外而全功尽弃。
杂交瘤细胞的冻存方法同其他细胞系的冻存方法一样，原则上细胞应在每支安瓿含1×106以上，但对原始孔的杂交瘤细胞可以因培养环境不同而改变，在24孔培养板中培养，当长满孔底时，一孔就可以冻一支安瓿。
细胞冻存液：
50％小牛血清
40％不完全培养液
10％DMSO（二甲亚砜）
冻存液最好预冷，操作动作轻柔、迅速。冻存时从室温可立即降到0 ℃，再降温时一般按每分钟降温2～3 ℃，待降至-70 ℃可放入液氮中。或细胞管降至0 ℃ 后放-70 ℃超低温冰箱，次日转入液氮中。也可以用细胞冻存装置进行冻存。冻存细胞要定期复苏，检查细胞的活性和分泌抗体的稳定性，在液氮中细胞可保存数年或更长时间。
五、单克隆抗体的大量生产
大量生产单克隆抗体的方法主要有两种
1. 体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞，从上清中获取单克隆抗体。但此方法产量低，一般培养液含量为10～60 μg/ml，如果大量生产，费用较高。
2. 体内接种杂交瘤细胞，制备腹水或血清。
（1）实体瘤法
对数生长期的杂交瘤细胞按1～3×107 /ml接种于小鼠背部皮下，每处注射0.2 ml， 共2～4点。待肿瘤达到一定大小后（一般10～20天）则可采血，从血清中获得单克隆抗体含量可达到1-10 mg/ml。但采血量有限。
对数生长期的杂交瘤细胞按1～3×107 /ml接种于小鼠背部皮下，每处注射0.2 ml， 共2～4点。待肿瘤达到一定大小后（一般10～20天）则可采血，从血清中获得单克隆抗体含量可达到1-10 mg/ml。但采血量有限。
（2）腹水的制备
常规是先腹腔注射0.5 mlPristane（降植烷）或液体石腊于BaLb/c鼠，1～2周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞，接种细胞7～10天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠频于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获1～10 ml腹水。也可用注射器抽取腹水，可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达5-20 mg/ml， 这是目前最常用的方法，还可将腹水中细胞冻存起来，复苏后转种小鼠腹腔则产生腹水快、量多。
常规是先腹腔注射0.5 mlPristane（降植烷）或液体石腊于BaLb/c鼠，1～2周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞，接种细胞7～10天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠频于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获1～10 ml腹水。也可用注射器抽取腹水，可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达5-20 mg/ml， 这是目前最常用的方法，还可将腹水中细胞冻存起来，复苏后转种小鼠腹腔则产生腹水快、量多。
六、单克隆抗体的鉴定
对制备的McAb进行系统的鉴定是十分必要的。应对其做如下方面的鉴定
1. 抗体特异性的鉴定
除用免疫原（抗原）进行抗体的检测外，还应用与其抗原成分相关的其它抗原进行交叉试验，方法可用ELISA、IFA法。例如
（1）制备抗黑色素瘤细胞的McAb，除用黑色素瘤细胞反应外，还应用其它脏器的肿瘤细胞和正常细胞进行交叉反应，以便挑选肿瘤特异性或肿瘤相关抗原的单克隆抗体。
（2）制备抗重组的细胞因子的单克隆抗体，应首先考虑是否与表达菌株的蛋白有交叉反应，其次是与其它细胞因子间有无交叉。
除用免疫原（抗原）进行抗体的检测外，还应用与其抗原成分相关的其它抗原进行交叉试验，方法可用ELISA、IFA法。例如
（1）制备抗黑色素瘤细胞的McAb，除用黑色素瘤细胞反应外，还应用其它脏器的肿瘤细胞和正常细胞进行交叉反应，以便挑选肿瘤特异性或肿瘤相关抗原的单克隆抗体。
（2）制备抗重组的细胞因子的单克隆抗体，应首先考虑是否与表达菌株的蛋白有交叉反应，其次是与其它细胞因子间有无交叉。
2. McAb的Ig类与亚类的鉴定
一般在用酶标或荧光素标记的第二抗体进行筛选时，已经基本上确定了抗体的Ig类型。如果用的是酶标或荧光素标记的兔抗鼠IgG或IgM，则检测出来的抗体一般是IgG类或IgM类。至于亚类则需要用标准抗亚类血清系统作双扩或夹心ELISA来确定McAb的亚类。在作双扩试验时，如加入适量的PEG（3 ％），将有利于沉淀线的形成。
一般在用酶标或荧光素标记的第二抗体进行筛选时，已经基本上确定了抗体的Ig类型。如果用的是酶标或荧光素标记的兔抗鼠IgG或IgM，则检测出来的抗体一般是IgG类或IgM类。至于亚类则需要用标准抗亚类血清系统作双扩或夹心ELISA来确定McAb的亚类。在作双扩试验时，如加入适量的PEG（3 ％），将有利于沉淀线的形成。
3. McAb中和活性的鉴定
用动物的或细胞的保护实验来确定McAb的生物学活性。例如如果确定抗病毒McAb的中和活性，则可用抗体和病毒同时接种于易感的动物或敏感的细胞，来观察动物或细胞是否得到抗体的保护。
用动物的或细胞的保护实验来确定McAb的生物学活性。例如如果确定抗病毒McAb的中和活性，则可用抗体和病毒同时接种于易感的动物或敏感的细胞，来观察动物或细胞是否得到抗体的保护。
4. McAb识别抗原表位的鉴定
用竞争结合试验、测相加指数的方法，测定McAb所识别抗原位点，来确定McAb的识别的表位是否相同。
用竞争结合试验、测相加指数的方法，测定McAb所识别抗原位点，来确定McAb的识别的表位是否相同。
5. McAb亲和力的鉴定
用ELISA或RIA竞争结合试验来确定McAb与相应抗原结合的亲和力。
用ELISA或RIA竞争结合试验来确定McAb与相应抗原结合的亲和力。
注意事项
一、影响因素、失败原因分析
由于制备McAb的实验周期长，环节多，所以影响因素就比较多，稍不注意就会造成失败。
其主要失败原因和影响因素有
1. 污染
包括细菌、霉菌和支原体的污染。这是杂交瘤工作中最辣手的问题。一旦发现有霉菌污染就应及早将污染板弃之，以免污染整个培养环境。支原体的污染主要来源于牛血清，此外，其它添加剂、实验室工作人员及环境也可能造成支原体污染。在有条件的实验室，要对每一批小牛血清和长期传代培养的细胞系进行支原体的检查，查出污染源应及时采取措施处理。对于污染的杂交瘤细胞可以采取生物学的过滤方法，将污染的杂交瘤细胞注射于BALB/c小鼠的腹腔，待长出腹水或实体瘤时，犖菌取出分离杂交瘤细胞，一般可除去支原体污染。
包括细菌、霉菌和支原体的污染。这是杂交瘤工作中最辣手的问题。一旦发现有霉菌污染就应及早将污染板弃之，以免污染整个培养环境。支原体的污染主要来源于牛血清，此外，其它添加剂、实验室工作人员及环境也可能造成支原体污染。在有条件的实验室，要对每一批小牛血清和长期传代培养的细胞系进行支原体的检查，查出污染源应及时采取措施处理。对于污染的杂交瘤细胞可以采取生物学的过滤方法，将污染的杂交瘤细胞注射于BALB/c小鼠的腹腔，待长出腹水或实体瘤时，犖菌取出分离杂交瘤细胞，一般可除去支原体污染。
2. 融合后杂交瘤不生长
在保证融合技术没有问题的前提下主要考虑下列因素
（1）PEG有毒性或作用时间过长。
（2）牛血清的质量太差，用前没有进行严格的筛选。
（3）骨髓瘤细胞污染了支原体。
（4）HAT有问题，主要是A含量过高或HT含量不足。
在保证融合技术没有问题的前提下主要考虑下列因素
（1）PEG有毒性或作用时间过长。
（2）牛血清的质量太差，用前没有进行严格的筛选。
（3）骨髓瘤细胞污染了支原体。
（4）HAT有问题，主要是A含量过高或HT含量不足。
3. 杂交瘤细胞不分泌抗体或停止分泌抗体
（1）融合后有细胞生长，但无抗体产生，可能是HAT中A失效或骨髓瘤细胞发生突变，变成A抵抗细胞所致。
（2）有可能是免疫原抗原性弱，免疫效果不好。
（3）对于原分泌抗体的杂交瘤细胞变为阴性，可能是细胞支原体污染，或非抗体分泌细胞克隆竞争性生长，从而抑制了抗体分泌细胞的生长。也可能发生染色体丢失。
Goding91982曾提出“三要”“三不要”，可能是防止抗体停止分泌的有效措施。
三要
要大量保持和补充液氮冻存的细胞原管。
要应用倒置显微镜经常检查细胞的生长状况。
要应用倒置显微镜经常检查细胞的生长状况。
要定期进行再克隆。
三不要
三不要
不要让细胞“过度生长”。因为非分泌的杂交瘤细胞将成为优势，压倒分泌抗体的杂交瘤细胞。
不要让培养物不加检查地任其连续培养几周或几个月。
不要不经克隆化而使杂交瘤在机体内以肿瘤生长形式连续传好几代。
4. 杂交瘤细胞难以克隆化
可能与小牛血清质量、杂交瘤细胞的活性状态有关，或由于细胞有支原体污染，使克隆化难以成功。若是融合后的早期克隆化，应在培养液加HT。
来源：丁香实验
