杨树单个细胞核制备的植物单细胞测序方法
上海烈冰生物医药科技有限公司
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众所周知，科研人的每一步都是在刀尖上舞蹈，任何一个成功的 protocol 背后，或许都有无数个「爆肝」的夜晚和经验累积，尤其是针对植物单细胞领域，大家都还在「摸着石头过河」的阶段，大多数研究是先获取原生质体后再行捕获单细胞进而测序，但原生质体的制备过程较为复杂，制备方法的专一性较强，在不同物种间难以直接迁移制备过程，甚至可能存在「彼之蜜糖，汝之砒霜」的效果。
因此这段时间，小编广罗各大科学网站，挖到几篇基于细胞核制备的植物单细胞测序的文章，本篇先和大家介绍一种能够从杨树单个细胞核而不是整个细胞中表征 mRNA 的方法，帮助大家减少因制备原生质体而带来的问题。
实验材料：
杨树梢尖（Populus tremula × alba INRA clone 717 1B4）和杨树茎（nisquly -1），两种材料均具有不同程度的细胞复杂性和细胞壁结构。试剂
10% 牛血清白蛋白封闭液、RNase 抑制剂、盐酸精胺、亚精胺、DTT、4X 细胞核分离缓冲液（40 mM MES-KOH pH 5.7, 40 mM NaCl, 40 mM KCl, 12mM MgCl2, 10 mM EDTA, 1M sucrose）、细胞核分离洗脱缓冲液（40 mM MES-KOH pH 5.7, 40 mM NaCl, 40 mM KCl, 12 mM MgCl2, 1M sucrose）耗材
镊子、无菌刀片、玻璃平板、移液枪、40uM 滤网、5ml带帽试管、50ml 离心管、1.5ml RNase-free 低吸附管实验设备
低温离心机、 恒温摇床、细胞分选仪等
详细实验步骤解析
制核效果验证
如上操作方法尽量减少了叶绿体等细胞器的污染和可能堵塞微流控芯片的细胞碎片，从制核结果来看，研究者获得了40000个DAPI+核（总回收体积67-70μl），可用于后续单细胞核测序实验。
基于10x Genomics平台的细胞核捕获及数据分析结果，测序数据基本饱和的情况下，Mean Reads per Nucleus在43000左右，mapping率＞73%，杨树茎组织的2个重复显示了表达基因之间的高度共性。
杨树组织细胞核制备注意事项
1、细胞核分离开始前，需将实验中所用的所有溶液、无菌刀片、各个规格的离心管、移液管等所需工具放置于0-4℃预冷至少30分钟，并在实验过程中保持低温状态（置于冰上）。2、整个实验过程需在冷室低温环境下操作，以减少RNA降解。
3、整个实验过程从植物材料收集到最终的分选，应在90分钟内完成，以减少RNA污染和降解。
4、制作组织匀浆时，应保证所有植物材料必须与含有RNA降解抑制剂的缓冲液接触。由于在样品制备的这一阶段可能会发生RNA降解，因此可以事后进行RNA提取和质量评估以验证其完整性。
5、离心、洗脱、转移匀浆等步骤操作均在冰上进行。
参考文献
A robust method of nuclei isolation for singlecell RNA sequencing of solid tissues from the plant genus Populus. PLoS One 2021 May 11;16(5):e0251149
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