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RNA的吸印转移法(Northern blot)

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在RNA凝胶电泳之前,先用乙二醛等变性剂处理RNA,再在适宜条件下电泳使充分变性的RNA直接吸印到硝酸纤维膜上。固定后除去变性剂,然后进行杂交。
试剂:
乙二醛:4mol/L(约为30%),经过阴阳离子交换树脂纯化,使pH为5.5~6.0
磷酸缓冲液:80mmol/L pH6.5~7.0 磷酸缓冲液:10mmol/L pH6.5~7.0
Tris-HCl:20mmol/L pH7.8 二甲基亚砜:分析纯 20×SSC:0.3mol/L柠檬酸钠,3mol/L NaCl

基本步骤
1.RNA变性   
吸取1μl 80mmol/L磷酸缓冲液,1μl RNA样品(最多100μg),2μl,4mol/L 乙二醇,4μl二甲基亚砜。混匀后,50℃水浴1h,然后放入冰中。
2.电泳 变性结束后,加入含有50%甘油的10mmol/L磷酸缓冲液2μl和少量溴酚蓝,混匀后点样于1.0%的凝胶上,以4~5V/cm电压电泳。凝胶电泳液为10mmol/L磷酸缓冲液, pH6.5~7.0。
3.转移
变性处理后的RNA可以转移并结合到硝酸纤维膜上,转移过程和转移变性与DNA相同。
4.固定
用20×SSC转移RNA。膜夹在两层干净滤纸中晾干,80℃烤膜2h。
RNA膜固定后,放入20mmol/L Tris-HCl中,100℃处理5~10min,去除乙二醛,然后进行杂交。

 

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