PriCells: 正常角膜缘干细胞的免疫染色
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试剂和材料:
1. 一抗:
(1) ABCG2-----------------小鼠单克隆BXP-21---------1:100
(2) 连接蛋白-43-----------兔多克隆CX43-------------1:100
(3) 细胞角蛋白3(K3)-----小鼠单克隆AE5----------- 1:500
(4) 细胞角蛋白12(K12)---兔多克隆J7-------------- 1:200
2. 二抗;
(1) 抗小鼠IgG-------------Alexa-488----------------1:2500
(2) 抗兔IgG---------------Alexa-546----------------1:1500
3. 封闭抗体:PBSA配制的10%热灭活羊血清;
4. Trion X-100;
5. PBSA;
6. 多聚甲醛(PFA),将16%原液用PBSA现配成4%的工作浓度;
7. Immu-Mount防褪色封片剂;
8. 载玻片和#1盖玻片;
9. 共聚焦显微镜;
实验方法:
1. 培养在塑料平皿或羊膜上的细胞;
2. CMF-Saline G洗一遍;
3. 用新鲜配制的4% PFA室温固定15min;
4. PBSA洗一遍;
5. 0.1% Triton X-100破膜10min;
6. 样本与一抗室温孵育1h;
7. PBSA洗2遍;
8. 加入二抗室温孵育1h;
9. 用PBSA洗2遍;
10. #1盖玻片,用最小体积的防褪色的封片剂封片;
11. 在荧光或共聚焦显微镜下用40×油镜对样本进行观察;