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PriCells: 正常角膜缘干细胞的免疫染色

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2064

试剂和材料:

1. 一抗:

(1) ABCG2-----------------小鼠单克隆BXP-21---------1:100

(2) 连接蛋白-43-----------兔多克隆CX43-------------1:100

(3) 细胞角蛋白3(K3)-----小鼠单克隆AE5----------- 1:500

(4) 细胞角蛋白12(K12)---兔多克隆J7-------------- 1:200

2. 二抗;

(1) 抗小鼠IgG-------------Alexa-488----------------1:2500

(2) 抗兔IgG---------------Alexa-546----------------1:1500

3. 封闭抗体:PBSA配制的10%热灭活羊血清;

4. Trion X-100;

5. PBSA;

6. 多聚甲醛(PFA),将16%原液用PBSA现配成4%的工作浓度;

7. Immu-Mount防褪色封片剂;

8. 载玻片和#1盖玻片;

9. 共聚焦显微镜;

实验方法:

1. 培养在塑料平皿或羊膜上的细胞;

2. CMF-Saline G洗一遍;

3. 用新鲜配制的4% PFA室温固定15min;

4. PBSA洗一遍;

5. 0.1% Triton X-100破膜10min;

6. 样本与一抗室温孵育1h;

7. PBSA洗2遍;

8. 加入二抗室温孵育1h;

9. 用PBSA洗2遍;

10. #1盖玻片,用最小体积的防褪色的封片剂封片;

11. 在荧光或共聚焦显微镜下用40×油镜对样本进行观察;

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